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Les salmonelles non typhoïdes invasives établissent une infection intracellulaire systémique chez les adultes infectés par le VIH: une pathogenèse émergente de la maladie

ContexteLes salmonelles sont des agents pathogènes intracellulaires facultatifs Les salmonelles non typhoïdes NTS provoquent une maladie muqueuse spontanément résolutive chez les adultes immunocompétents, mais une maladie invasive et récurrente chez les adultes infectés par le VIH en Afrique L’importance de l’infection intracellulaire NTS dans le VIH est inconnueMéthodesNous avons réalisé une culture quantitative des échantillons de sang obtenus lors d’événements fébriles chez les adultes malawiens et NTS ont été isolés lors d’événements. Quatre-vingt-dix-huit pour cent étaient infectés par le VIH, avec un nombre moyen de cellules CD / μL. de NTS intracellulaires dans le sang et la moelle osseuseRésultatsCNTS totaux viables dans le sang étaient une unité formant une colonie [UFC] / mL mais corrélée indépendamment avec une numération CD plus faible et avec des niveaux IL- et IL-, en particulier à la récidive, suggérant l’échec de l’infection intracellulaire La charge NTS viable dans le sang et la moelle osseuse était étroitement corrélée événements de l’index, mais NTS étaient significativement concentrés dans la moelle osseuse, comparé aux échantillons sanguins, à des récidives vs CFU / mL, suggérant la réplication tissulaire systémique à la fois lyse-pour-placage et test d’exclusion de gentamicine démontré infection intracellulaire avec & gt; Cellules CFU / cellules dans des échantillons de sang et de moelle osseuse Des bactéries intracellulaires ont été mises en évidence dans la moelle osseuse à la fois pour des événements récidivants et récidivants, ce qui montre qu’il s’agit d’une caractéristique précoce et persistante de la pathogenèse. patients avec un nombre de CD & lt; cellules / μL Intravasculaire NTS à la récidive peut donc refléter extracellulaire « overspill » d’un site sanctuaire intracellulaire, suite à l’échec du contrôle immunologiqueConclusionsNTS INCives ont établi une pathogenèse nouvelle et émergente dans le contexte de l’infection par le VIH en Afrique

Les salmonelles sont des agents pathogènes intracellulaires facultatifs. Salmonella enterica sérovar Typhi est exclusivement réservé aux humains, et la réplication intracellulaire précoce dans les cellules mononucléaires réticulo-endothéliales est essentielle pour la pathogenèse Par contre, les sérotypes non-typhoïdiques de Salmonella NTS ont une large gamme d’hôtes. Les NTS ont pendant de nombreuses décennies été une cause fréquente de maladie invasive chez les enfants africains, les principaux facteurs de risque étant le paludisme, l’anémie et la malnutrition. La maladie invasive du NTS a été décrite pour la première fois chez des patients africains atteints du SIDA. Les États-Unis dans le milieu et les événements récurrents ont été notés comme une caractéristique dans les deux groupes Nas envahissant chez les adultes infectés par le VIH virus de l’immunodéficience humaine est maintenant une maladie émergente et grave en Afrique subsaharienne, mais l’importance de l’infection intracellulaire dans La pathogénie invasive du SNT n’est pas établie La fièvre typhoïde, par contre, ne Cependant, nous avons récemment montré que l’épidémie de NBS envahissante au Malawi est causée par une nouvelle séquence de type ST de Salmonella Typhimurium qui montre une dégradation du génome similaire à celle observée chez Salmonella. Typhi, suggérant l’évolution convergente d’un nouveau pathovariant vers un phénotype restreint à l’hôte Les SNT sont les isolats bactériens les plus courants des admissions hospitalières fébriles dans les régions africaines infectées par le VIH , et% des adultes atteints du VIH invasif Le taux de létalité est dévastateur% -% et% -% de survivants expérimentés recrudescence bactériémique Nous émettons l’hypothèse que NTS recrudescent ré-émerge d’un site sanctuaire intracellulaire Les cultures quantitatives peuvent aider à comprendre la pathogenèse des infections de flux sanguin et ont établi une association entre la charge viable plus élevée et la mort dans la septicémie à Gram négatif Wain et al ont trouvé des comptes viables de S Typhi dans bl Ils ont également noté une concentration de bactéries dans la moelle osseuse, et la lyse des échantillons de sang et de moelle osseuse a démontré la présence de bactéries intracellulaires au cours de la fièvre typhoïde. méthode de plaque d’or standard pour comparer directement la charge NTS viable à partir d’échantillons de sang et de moelle osseuse prélevés simultanément pendant la maladie aiguë invasive NTS et pour corréler la charge NTS avec des marqueurs potentiels de la gravité de la maladie Nous avons également utilisé des méthodes infection intracellulaire: placage de prélèvements de sang et de moelle osseuse lysés et non lysés et traitement ex vivo par la gentamicine d’échantillons de sang et de moelle osseuse avant la lyse et la culture sur plaque

Méthodes et matériaux

Recrutement et gestion de sujets

Les sujets ont été recrutés à partir de la température fébrile consécutive séquentielle, ax ° C adultes axillaires âgés, & gt; années admises à l’hôpital central Queen Elizabeth Blantyre, Malawi Le sang veineux a été prélevé avant le traitement antibiotique pour la culture sanguine en bouillon mL, la culture quantitative en plaque pour le mL, le test VIH Unigold et Serocard; Trinity Biotech, et la détermination du compte de CD Trucount; Becton Dickinson Des échantillons de selles et d’urine ont été prélevés avant traitement antibiotique. Un consentement éclairé supplémentaire a été obtenu pour l’échantillonnage percutané de la moelle osseuse – mL dans des conditions stériles avec anesthésie locale% lignocaïne au niveau de la crête iliaque traités avec empirique par la ciprofloxacine orale Les cultures de sang et de moelle osseuse ont été répétées au suivi seulement si les sujets étaient des patients témoins fébriles VIH-positifs chez l’adulte sans signe d’intercurrence. infection ou autres problèmes de santé chroniques ont été recrutés parmi les patients se rendant dans les cliniques Aucun patient sujet ou contrôle n’a reçu de traitement antirétroviral, car cette étude est antérieure à la disponibilité de médicaments antirétroviraux gratuits du Fonds mondial au Malawi

Méthodes de laboratoire clinique

Le mL de sang veineux pour culture aérobie en mL de bouillon a été incubé pendant des jours BacT / Alert D; Des échantillons de selles BioMerieux ont été cultivés dans du bouillon de sélénite pendant une nuit, puis étalés sur de la gélose XLD. Tous les microorganismes ont été identifiés par des méthodes standard Les antibiogrammes microlitres de chaque échantillon d’urine a été placé sur une plaque d’agar d’isosensibilité étalée avec Escherichia coli NCTC entièrement sensible L’observation de toute zone d’inhibition après h d’incubation à ° C a indiqué la présence d’une activité antimicrobienne non spécifiée dans les urines. dilué: dans du PBS salin tamponné au phosphate, et le pourcentage de pureté de la moelle osseuse de l’hémodilution a été estimée en utilisant la formule suivante: où RBC est des globules rouges, bm est la moelle osseuse, b est le sang et WBC est des globules blancs [IFN] γ, facteur de nécrose tumorale a, interleukine [IL] -, IL-, IL-, et I L- ont été mesurés en utilisant le Becton Dickinson Cytometric Bead Array, et la charge plasmatique en VIH a été mesurée en utilisant le test COBAS TaqMan HIV / Roche

Méthodes quantitatives de culture en plaque-versée

On a mélangé du sang veineux hépariné mL et de la moelle osseuse mL avec du PBS témoin ou du% digitonine pendant min pour libérer les bactéries intracellulaires – des aliquotes de mL ont été mélangées dans des plaques de coulée avec des mL d’agar Columbia Columbia fondu et incubées à ° C. et ramassé à la surface pour l’identification Les plaques sans croissance et les plaques contaminées ont été jetés Un phagocyte non lysé contenant & gt; des organismes / cellule intracellulaires produisent une seule colonie noyée dans une culture en plaque en phase solide mais de multiples colonies si elles sont lysées avant la culture en plaques. Cependant, les phagocytes contenant un organisme / cellule intracellulaire ne produiront pas de colonies multiples après la lyse. par rapport à des échantillons non lysés, a donc indiqué une infection intracellulaire avec & gt; La charge totale de NTS viable a été définie comme étant le nombre d’unités lysées dans des unités formant des colonies CFU / mL. Le volume de sang et de moelle osseuse utilisé pour la culture quantitative était de mL et mL pour chaque condition, UFC / mL et UFC / mL, respectivement Une valeur nominale inférieure de UFC / mL a été attribuée lorsque la culture sanguine en bouillon était positive mais que les plaques étaient négatives Lorsque les données sur le sang et la moelle osseuse étaient comparées, la numération sanguine & lt; CFU / mL ont été ajustés à CFU / mL, pour éviter le biais résultant de différentes limites inférieures de détection

Traitement de la gentamicine d’échantillons cliniques ex vivo

Une série séparée d’échantillons de sang et de moelle osseuse a été incubée avec de la gentamicine μg / mL, pour tuer les bactéries extracellulaires mais pas intracellulaires, ou a été traitée avec du PBS pendant min à ° C. La gentamicine a été éliminée par trois lavages PBS -mL et centrifugation g pour min Le culot final de cellules et de bactéries extracellulaires a été remis en suspension dans% digitonin pour les cellules min à lyse, et la culture en plaque a été réalisée comme décrit ci-dessus. Les comptages d’échantillons lysés non-gentamicin-traités ont indiqué la charge NTS viable totale, et les des échantillons lysés traités avec de la gentamicine ont indiqué le nombre de bactéries intracellulaires Tous les isolats ont été testés rétrospectivement pour confirmer la sensibilité à la gentamycine comme démontré par un -log tuer par μg / mL de gentamicine

analyses statistiques

Les données ont été évaluées en utilisant Stata, version StataCorp Comme les mesures continues suivaient des distributions non-normales, des tests de somme-rank ont ​​été utilisés pour les comparaisons intra-groupe, les tests de Mann-Whitney pour les comparaisons entre groupes et la corrélation de rang de Spearman pour les tests d’association. les échantillons lysés et non lysés ont été évalués à l’aide de diagrammes de Bland-Altman

Approbation éthique

L’approbation éthique pour cette étude a été donnée par le comité d’éthique de la recherche de l’École de médecine tropicale de Liverpool et par le comité d’éthique de la recherche du Collège de médecine de l’Université du Malawi.

Résultats

Description clinique des événements invasifs du SNRC

Quatre cent quatre-vingt-quinze adultes malawiens fébriles% hommes; l’âge médian, les années ont eu le bouillon et les cultures quantitatives de sang ont exécuté à des occasions à la présentation d’index; Lors de visites fébriles Deux cent dix sujets avec des cultures quantitatives à indice positif et avec une culture de bouillon de routine positive en dehors des heures d’étude ont été suivis des visites de suivi mensuelles. Une culture quantitative simultanée de la moelle osseuse a été réalisée à l’occasion. jusqu’à la fébrilité Cent onze fébriles adultes% hommes; âge médian, années; Intervalle de confiance en%, les années ont eu des cultures positives pour le SNRC du sang ou de la moelle osseuse lors d’événements et de récurrences. La détection des événements positifs du SNS est résumée à la figure. récurrences et les patients ont eu plusieurs récurrences

Figure Vue largeTélécharger la diapositive Résumé des événements salmonellae invasifs non-typhoïdiques positifs à la culture identifiés par culture en bouillon sanguin, QBC quantitatif en culture hématologique et cultures quantitatives de moelle osseuse QBMCFigure View largeTélécharger le diaporama des salmonelles invasives non-typhoïdes positives à la culture identifiées par culture en bouillon sanguin, culture de sang quantitatif QBC, et les cultures quantitatives de moelle osseuse QBMCDuration de la fièvre avant la présentation était une médiane de jours range, – jours; 10% des décès sont survenus dans le mois qui a suivi la présentation de l’indice Ceci est inférieur à ce qui a été rapporté précédemment à Blantyre, peut-être parce que les patients ayant une conscience altérée n’ont pas pu donner leur consentement éclairé

Description en laboratoire des événements NTS invasifs

Parmi les isolats SNT,% étaient Typhimurium S,% étaient Salmonella Enteritidis et% étaient d’autres sérovars Soixante-douze pour cent de NTS étaient MDR% de S Typhimurium et% d’isolats de S Enteritidis Aucune résistance à l’acide nalidixique ou à la ciprofloxacine n’a été détectée Activité antimicrobienne détectée dans les échantillons d’urine selon% d’événements index et% d’événements de suivi pour lesquels un échantillon était disponible NTS ont été isolés de% d’événement indice et% d’échantillons récurrents de selles d’événementLes valeurs médianes pour les paramètres de numération sanguine parmi les patients avec un événement NTS positif étaient comme suit: hémoglobine, intervalle interquartile g / dL [IQR], – g / dL; nombre de globules blancs, × cellules / μL IQR, × – × cellules / μL; et numération plaquettaire, × plaquettes / μL IQR, × – × plaquettes / μL Quatre-vingt douze pour cent des sujets testés étaient séropositifs. La numération des CD était disponible pour les sujets à indice et récurrence, avec un nombre moyen de cellules CD / μL IQR, – cellules / μL La charge sérique du VIH, mesurée lors d’événements aigus et de suivi, était une médiane de × copies / mL, × – × copies / mL Les paramètres de numération globulaire, le nombre de CD et la charge virale n’étaient pas différents à l’index par rapport à récurrents La pureté de la moelle osseuse de l’hémodilution était de%% intervalle de confiance,% -%

Quantité totale de NTS viable provenant du sang

La charge médiane viable NTS dans les échantillons de sang de tous les événements hémoculturiques positifs était UFC / mL IQR, – CFU / mL Les charges viables d’autres pathogènes détectés sont rapportées dans le tableau sanguin NTS charge était plus élevée aux événements index, par rapport aux événements récurrents, dans un -échantillon d’analyse de tous les événements indice d’événement [n =] médiane, UFC / mL [IQR, – UFC / mL] vs événement de récidive [n =] médiane, UFC / mL [IQR, – CFU / mL; P = La charge viable de NTS dans le sang n’a pas varié selon le sexe, l’âge, le sérovar, la MDR, la présence d’activité antimicrobienne dans l’urine, la culture de selles positive, la durée de la fièvre ou la récidive. un taux plus élevé d’isolement des isolats MDR% MDR chez les sujets ayant une activité antimicrobienne détectée et% MDR chez les sujets sans activité antimicrobienne détectée

Tableau Viable rendement des cultures quantitatives pour d’autres pathogènes isolés du sang et de la moelle osseuse des adultes fébriles Ce tableau est disponible dans son intégralité dans la version en ligne de Clinical Infectious Diseases Ce tableau est disponible dans son intégralité dans la version en ligne de Clinical Infectious Diseases View Large

Tableau Relation entre les paramètres cliniques et de laboratoire pour la viabilité des salmonelles non typhoïdes NTS dans le sang et la moelle osseuse lors d’événements SNP envahissants Corrélation avec la charge du SNRC sanguin Corrélation avec la charge BM NTS Charge sanguine variable NTS, UFC / mL IQR Nombre d’événements Pa ρ P BM NTS charge, UFC / mL IQR Nombre d’événements Pa ρ P Salmonella Typhimurium – … – … Salmonella Enteritidis – … – … MDR – … – … Non-MDR – … – … Antimicrobialc – … – … Pas d’antimicrobien – … – … NTS dans les selles – … – … Pas de NTS dans les selles – … – … Durée de la fièvre … … – Mois de récurrence … … CD & lt; cellules / μL – d – d – – CD ⩾ cellules / μL – … – … niveau d’Hb & lt; g / dL – – d – – Niveau d’Hb ⩾ g / dL – … – … Nombre de globules blancs & lt; × cellules / μL – – – – nombre de globules blancs ⩾ × cellules / μL – … – … nombre de plaquettes & lt; × plaquettes / μL – d – d – – numération plaquettaire ⩾ × plaquettes / μL – … – … niveau IL … & lt; d … – niveau IL … & lt; d … Corrélation avec le sang NTS loadb Corrélation avec loader BM NTS Variable Blood Charge NTS, UFC / mL IRQ Nombre d’événements Pa ρ P BM Charge NTS, UFC / mL IQR Nombre d’événements Pa ρ P Salmonella Typhimurium – … – … Salmonella Enteritidis – … – … MDR – … – … Non-MDR – … – … Antimicrobialc – … – … Pas d’antimicrobien – … – … NTS dans les selles – … – … Pas de NTS dans les selles – … – … Durée de la fièvre … … – Mois de récurrence … .. collagène. CD & lt; cellules / μL – d – d – – CD ⩾ cellules / μL – … – … niveau d’Hb & lt; g / dL – – d – – Niveau d’Hb ⩾ g / dL – … – … Nombre de globules blancs & lt; × cellules / μL – – – – nombre de globules blancs ⩾ × cellules / μL – … – … nombre de plaquettes & lt; × plaquettes / μL – d – d – – numération plaquettaire ⩾ × plaquettes / μL – … – … IL- niveau … & lt; d … – IL- niveau … & lt; d … NOTE Hb, hémoglobine; IL, interleukine; MDR, résistance multidrogue; WBC, cellule de sang blancBy-échantillon test de rangbCorrelation de variables continues avec charge NTS viable a été évaluée en utilisant Spearman’s rank testc Activité antimicrobienne détectée dans des échantillons d’urine prélevés, avant le traitement, à l’admissiondRésultat significatif, entré en analyse de régression multivariée

Charge totale de NTS viable provenant de la moelle osseuse

La charge médiane viable NTS de la moelle osseuse cultivée chez les sujets était de 1,04 UFC / ml d’IQR, – CFU / mL et tendait à être plus élevée à la récidive, comparée aux événements index, bien que cela n’atteigne pas la signification statistique P =; Dans l’ensemble, la charge NTS viable était plus élevée dans la moelle osseuse que dans le sang, et il y avait une corrélation globale entre le sang et la moelle osseuse. À la récidive, la charge NTS viable était significativement plus élevée dans la moelle osseuse, comparée aux échantillons de sang vs CFU / mL, et la corrélation entre la charge viable dans la moelle osseuse. le sang et la moelle osseuse étaient moins forts La charge viable de NTS de la moelle osseuse ne variait avec aucun paramètre clinique ou de laboratoire.

Tableau Total des cas de salmonellose non typhoïde viable dans le sang, comparativement à la moelle osseuse BM, provenant d’échantillons appariés prélevés au même événement Corrélation entre la charge de NTS dans le sang et le BMB Nbre d’événements Charge NTS viable dans le sang, UFC / mL IQR viable NTS charge en BM, UFC / mL Paq P ρ P NTS invasive – – & lt; Index – – Récurrence – – & lt; Corrélation entre la charge de NTS dans le sang et les événements BMb Nbre d’événements Charge NTS viable dans le sang, UFC / mL Charge NTS viable dans BM, CFU / mL Paq P ρ P NTS invasive – – & lt; Index – – Récurrence – – & lt; aComparaison de la charge viable dans le sang par rapport à BM, évaluée à l’aide du test apparié de Wilcoxon bCorrélation de la charge viable dans le sang avec la charge viable dans BM, évaluée en utilisant le test de Spearman.

Figure Vue largeTélécharge Diagramme de dispersion comparatif montrant la présence de salmonelles non-typhoïdes viables dans le sang apparié et la moelle osseuse bm à l’indice n = et la récurrence récidivante; n = événements Les lignes horizontales rouges indiquent les valeurs médianesFigure Vue largeTéléchargement de diapositivesDispositif de dispersion comparatif montrant la présence de salmonelles non typhoïdes viables dans le sang apparié et la moelle osseuse bm à l’indice n = et récidivante récurrente; n = événements Les lignes horizontales rouges indiquent les valeurs médianes

Corrélation de la charge NTS viable dans le sang avec les paramètres biologiques et immunologiques

Nous avons précédemment montré un faible taux d’hémoglobine et un nombre de CD associés respectivement à des mortalités précoces et tardives à la suite d’une bactériémie NTS En analyse univariée, la charge sanguine NTS était significativement plus élevée chez tous les patients présentant un taux de plaquettes. × plaquettes / μL ou CD compte & lt; cellules / μL La charge NTS viable dans le sang était significativement inversement proportionnelle au nombre de plaquettes, au taux d’hémoglobine et au nombre de CD. Il n’y avait pas de relation entre la charge de NTS dans le sang et le VIH. âge médian, années; numération CD médiane, cellules / μL [IQR, – cellules / μL] Les taux sériques d’IL- et d’IL- étaient significativement élevés pendant les événements NTS invasifs aigus, comparés aux témoins. Tableau Il y avait une corrélation positive hautement significative Niveaux et niveaux IL- à tous les événements NTS invasifs sur l’analyse univariée Tableau Il y avait une corrélation entre les niveaux IL- et IL- ρ =; P & lt; mais pas de corrélation des niveaux de cytokines avec le nombre de CD

Tableau Niveaux de cytokine sérique chez les patients atteints d’événements non confirmés de salmonellose non typhoïde et de témoins VIH positifs pour le virus de l’immunodéficience humaine Cytokine, événement Nombre d’échantillons Niveau médian de cytokine, pg / mL% CI Pa IL Tous les NTS invasifs aigus – & lt; Index – & lt; Récurrence – & lt; Lutte contre le VIH – IL – Tout NTS envahissant aigu – & lt; Index – & lt; Récurrence – & lt; Contrôle anti-VIH – Cytokine, événement Nombre d’échantillons Niveau médian de cytokine, pg / mL% CI Pa IL Tous les NTS envahissants aigus – & lt; Index – & lt; Récurrence – & lt; Lutte contre le VIH – IL – Tout NTS envahissant aigu – & lt; Index – & lt; Récurrence – & lt; Contrôle séropositif – NOTE CI, intervalle de confiance; IL, interleukinaLa comparaison statistique avec le contrôle VIH-positif a été réalisée en utilisant Mann-Whitney -sample rank-sum testView LargeA analyse de régression multivariée avec log du sang viable NTS charge comme la variable dépendante a confirmé des relations indépendantes avec le nombre de CD & gt; cellules / μL, logarithmes des niveaux IL et logarithmes des niveaux d’IL P =, P = et P = respectivement, mais pas avec un faible nombre de plaquettes P = ou un faible taux d’hémoglobine P = modèle R = nombre de CD, niveau IL- et Les taux d’IL étaient tous plus fortement corrélés avec la charge NTS viable dans le sang lors d’événements récurrents CD, ρ = – et P =; IL-, ρ = et P & lt; ; IL-, ρ = et P & lt; qu’aux événements d’indice CD, ρ = – et P =; IL-, ρ = et P =; IL-, ρ = et P =

Preuve d’infection intracellulaire: échantillons de sang non lysés vs lysés

Dans l’ensemble, les numérations viables médianes étaient significativement plus élevées dans les échantillons de sang lysé CFU / mL, comparés aux échantillons de sang non lysés. CFU / mL Tableau et figure Cette augmentation des comptes sur la lyse était significative aux événements index P & lt; mais pas à des événements récurrents P = Table et Figure, ce qui suggère que l’infection intracellulaire intravasculaire avec & gt; CFU / cellule se produit uniquement à des événements d’indice L’augmentation du nombre de NTS dans le sang sur la lyse était également significative chez les sujets avec CD compte & lt; cellules / mL mais pas celles avec CD compte les cellules / μL Tableau, en accord avec l’importance des cellules CD dans le contrôle de l’infection intracellulaire

Tableau Non-typhoïde Salmonellae NTS Nombre de cas viables provenant d’échantillons appariés non lysés et lysés de sang et de moelle osseuse dénombrements viables NTS, médiane CFU / mL IQR Source d’échantillon, événement Nombre d’échantillons Lyseda non sanglée Sang Pb Tous les événements – – & lt; Index – – & lt; Récurrence – – Nombre de CD & lt; cells / μL – – Nombre de CD & gt; cellules / μL – – Moelle osseuse Tous les événements – – & lt; Index – – Récurrence – – & lt; Nombre de CD & lt; cells / μL – – Nombre de CD & gt; cellules / μL – – comptes viables NTS, UFM médian / mL Source d’échantillon, événement Nombre d’échantillons Lyseda Ply sang lysé Tous les événements – – & lt; Index – – & lt; Récurrence – – Nombre de CD & lt; cells / μL – – Nombre de CD & gt; cellules / μL – – Moelle osseuse Tous les événements – – & lt; Index – – Récurrence – – & lt; Nombre de CD & lt; cells / μL – – Nombre de CD & gt; cellules / μL – – NOTE Voir également Figures et UFC, unités formant des colonies; IQR, le nombre interquartile rangeaLysed a été défini comme le total viable NTS loadb Comparaison d’échantillons appariés lysed vs non lysé était par le test de rang de signe apparié de Wilcoxon Large

Figure Vue large Diapositive de téléchargement Diagrammes de bulles montrant la relation entre la charge bactérienne viable et le sang non lysé et lysé apparié A; n = et moelle osseuse non lysée et lysée B; n = échantillons lors d’événements invasifs de salmonelles non typhoïdes Les points plus grands représentent plusieurs points de données superposés nombre proportionnel à la surface La ligne diagonale représente la ligne d’égalité où l’unité formant une colonie non lysée est égale au nombre d’UFC lysées Augmentation du nombre de lys lorsque les points sont au-dessus cette ligne, suggère une infection intracellulaire avec & gt; CFU / mLFigure View largeDownload Diagrammes des bulles montrant la relation entre la charge bactérienne viable et le sang non lysé et lysé apparié A; n = et moelle osseuse non lysée et lysée B; n = échantillons lors d’événements invasifs de salmonelles non typhoïdes Les points plus grands représentent plusieurs points de données superposés nombre proportionnel à la surface La ligne diagonale représente la ligne d’égalité où l’unité formant une colonie non lysée est égale au nombre d’UFC lysées Augmentation du nombre de lys lorsque les points sont au-dessus cette ligne, suggère une infection intracellulaire avec & gt; CFU / mL

Figure vue grandDownload slideBland-Altman parcelles pour évaluer l’égalité de compte viable entre les échantillons de sang non lysés et lysés à l’indice A; n = et récurrent B; n = événements de salmonelles non invasives typhoïdes voir tableau Les plus grands points représentent de multiples points de données sus-jacentes Le nombre de sujets viables est augmenté lors de la lyse à des événements d’index, suggérant une infection intracellulaire avec & gt; CFU / mL, mais la numération viable n’est pas augmentée lors de la lyse lors d’événements récurrentsFigure View largeTélécharger la diapositiveBland-Altman pour évaluer l’égalité de compte viable entre les échantillons de sang non lysés et lysés à l’indice A; n = et récurrent B; n = événements de salmonelles non invasives typhoïdes voir tableau Les plus grands points représentent de multiples points de données sus-jacentes Le nombre de sujets viables est augmenté lors de la lyse à des événements d’index, suggérant une infection intracellulaire avec & gt; CFU / mL, mais la numération viable n’est pas augmentée lors de la lyse lors d’événements récurrents

Preuve d’infection intracellulaire: échantillons non lysés vs moelle osseuse lysée

Les numérations NTS médianes de la moelle osseuse cultivées chez les sujets étaient significativement plus élevées dans les UFC / mL lysées, comparées aux UFC / mL non lysées P & lt; ; Tableau et figure L’augmentation du nombre médian de lyse de la moelle osseuse était plus importante que celle du sang, ce qui suggère un taux plus élevé d’infection intracellulaire dans la moelle osseuse que dans le sang. Les taux de lyse de la moelle osseuse étaient significatifs à la fois pour l’indice et pour les événements récurrents et étaient significatifs pour tous les comptes de CD et montrent que, bien que la dispersion des données était plus importante à des charges NTS viables plus faibles attribuables à une sensibilité et une discrimination réduites, infection intracellulaire avec & gt; CFU / cellule a été vu à travers toute la gamme des charges bactériennes, dans le sang et la moelle osseuse

Preuve d’infection intracellulaire: échantillons cliniques traités par la gentamicine

Cinq sujets fébriles de la série gentamicine présentaient des cultures quantitatives positives de sang et de moelle osseuse pour NTS et des isolats sensibles à la gentamicine. Les données sont montrées sur la figure 1: un échantillon était prélevé lors d’un événement récurrent et aucun NTS n’était produit après traitement à la gentamicine. Des échantillons ont été prélevés chez les autres sujets lors des présentations d’index. Il subsistait des bactéries intracellulaires viables après traitement par la gentamicine dans des échantillons de sang des sujets X et X et dans la moelle osseuse des sujets X et X. Ces données fournissent des preuves supplémentaires, en utilisant une seconde méthode. infection intracellulaire dans le sang et la moelle osseuse au cours de la maladie invasive du SNT

Figure View largeDownload slideViable compte de salmonelles non typhoïdes NTS suite à un traitement de Gentamicine Gent ex vivo, ou un traitement simulé avec du PBS salin tamponné au phosphate suivi d’une lyse de sang clinique et de moelle osseuse BM échantillons obtenus lors d’événements invasifs NTS chez des sujets Croissance viable après lyse seul le bleu et le vert représentent la charge totale viable NTS croissance viable suite à la gentamicine traitement et la lyse orange ou rouge provient des organismes intracellulairesFigure View largeTélécharger diapositiveCompte fiable de salmonelles non typhoïde NTS suite à un traitement ex gentamicine Gent, ou un traitement simulé avec phosphate salin tamponné PBS, suivi de la lyse du sang clinique et de la moelle osseuse BM échantillons obtenus lors d’événements NTS invasifs chez des sujets Croissance viable après lyse seule bleu et vert représente la charge NTS totale viable Croissance viable suite au traitement par la gentamicine et la lyse orange ou rouge provient des organismes intracellulaires

Discussion

nd cas avec une charge viable & lt; CFU / mL peut ne pas avoir été détecté par le bouillon combiné et la culture quantitative – Volume total de culture ML Les méthodes que nous avons utilisées ne donnent qu’une estimation minimale du degré d’infection intracellulaire La méthode de lyse pour plaque peut seulement détecter & gt; CFU / cellule; par conséquent, même une légère augmentation des dénombrements après la lyse est susceptible d’indiquer un niveau biologiquement important d’infection intracellulaire. De même, la forte concentration de gentamicine utilisée pour tuer les bactéries extracellulaires pourrait permettre une pénétration par pinocytose et, par conséquent, la destruction de certaines bactéries intracellulaires. l’infection dans la moelle osseuse a été démontrée à la fois dans les cas d’index et de récidive, et la charge NTS viable était significativement plus élevée dans la moelle osseuse lors d’événements récidivants, suggérant que l’infection intracellulaire réticulo-endothéliale est établie tôt, même lors de la première présentation. infection intracellulaire avec & gt; La concentration de CFU / mL n’a été démontrée que dans le sang lors d’événements indiciels, mais pas lors d’événements récurrents, suggérant des processus biologiquement distincts. Ceci est cohérent avec l’invasion initiale de Salmonella observée dans des modèles animaux; Les salmonelles migrent à travers la muqueuse, puis envahissent et se propagent dans les cellules mononucléaires. Comme la charge de SNT sanguine viable à la récidive n’est pas intracellulaire, des événements NTS récurrents peuvent résulter d’un «débordement» extracellulaire après échec immunologique du contrôle des bactéries intracellulaires dans les cellules. Sites de sanctuaires tissulaires On sait que les lymphocytes T CD sont nécessaires pour la clairance tardive des salmonelles invasives et constituent une source cellulaire importante d’IFN-γ, qui active les macrophages pour lutter contre les salmonelles par voie nitrosative IL- est un contre- La Th-cytokine régulatrice, et la neutralisation des IL-induisent une protection contre la maladie de Salmonella IL- est surproduite dans l’infection VIH avancée , et nous avons déjà montré que la production de IL par des macrophages tissulaires ex vivo infectés par Salmonella est dérégulée la maladie du VIH tardive, dans un modèle lié au nombre de CD La corrélation de la charge NTS viable dans le sang avec ces paramètres immunologiques spécifiquement une La récurrence intracellulaire médiée par Th est nécessaire pour éliminer l ‘infection NTS et prévenir la recrudescence intravasculaire. La réplication réticulo – endothéliale intracellulaire pendant la fièvre typhoïde est essentielle pour établir l’ infection secondaire de Peyer, le portage chronique et la transmission Wain et al. Nous n’avons pas démontré d’association entre la charge de NTS et la culture de selles positives ou avec des isolats de MDR, malgré la transmission épidémique de MDR NTS au Malawi Nous ne pouvions toutefois démontrer que des charges bactériennes dans la fièvre typhoïde. Des études supplémentaires visant à comprendre les mécanismes de persistance, de distribution et de transmission du SNT dans les populations où le VIH est prévalent sont nécessaires pour comprendre les mécanismes de la maladie invasive du SNRC. pathogenèse émergente dans le contexte de la maladie à VIH en Afrique l’échec immunologique de l’abattage intracellulaire et l’émergence de pathovariants NTS régionaux potentiellement adaptés à l’hôte sont probablement des contributeurs à ce comportement. Il est frappant de constater que S Typhi ne semble pas exploiter cette niche.Les implications pratiques de ces découvertes sont importantes. La faible charge de NTS peut empêcher le développement de tests de diagnostic rapides d’amplification des acides nucléiques. Cependant, les NTS sont concentrés dans la moelle osseuse au moment de la récidive, et l’échantillonnage de la moelle osseuse pourrait augmenter le diagnostic. Une étude post mortem a démontré la croissance du SNN à partir de la rate d’adultes sud-africains infectés par le VIH avec un diagnostic ante mortem de la tuberculose, suggérant que la persistance des tissus D’autres études portant sur le diagnostic microbiologique Le traitement et la prophylaxie optimaux du SNT invasif chez les adultes infectés par le VIH ne sont pas évalués Il existe une utilisation pragmatique croissante de la ceftriaxone pour le traitement empirique des présentations fébriles chez les enfants et les adultes infectés par le VIH en Afrique , mais l’expérience dans la fièvre typhoïde suggère que cela pourrait être associé à des niveaux plus élevés d’échec du traitement, par rapport à l’utilisation de fluoroquinolones, qui ont une pénétration intracellulaire optimale Il faut espérer que l’introduction et l’expansion de la thérapie antirétrovirale En raison de l’infection intracellulaire systémique précoce et soutenue que nous avons observée, les vaccins NTS en développement doivent produire une forte réponse immunitaire à médiation cellulaire, en plus de la protection muqueuse et humorale.

Remerciements

Nous aimerions remercier les patients et le personnel de l’Hôpital Queen Elizabeth Central, Blantyre, Malawi. Nous aimerions également souligner à titre posthume les contributions essentielles du Professeur Anthony Anthony Hart, Université de Liverpool, Royaume-Uni, à ce travail. Soutien financier Wellcome Trust UK Training Fellowship aux conflits d’intérêt de MAGPotential Tous les auteurs: aucun conflit

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