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Traitement de récupération rapide avec des cellules T spécifiques du virus pour la maladie résistante à la thérapie

Contexte Les infections virales sont des complications majeures après greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques HSCT Pendant l’immunosuppression posttransplantation, le contrôle régulier des lymphocytes T est compromis Même si les stratégies de traitement contre les infections causées par les virus herpétiques tels que cytomégalovirus, virus d’Epstein-Barr et adénovirus se sont améliorées, Si les traitements antiviraux primaires échouent ou ne peuvent être tolérés, une thérapie adoptive avec des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques du virus peut être utilisée. Méthodes Dans cette étude, nous avons utilisé des CTL spécifiques du virus pour traiter 8 patients souffrant d’infections virales sévères après HSCT allogénique. sélection positive avec des multimères HLA et des billes magnétiques, nous avons isolé les CTL des donneurs congelés ainsi que des donneurs tiers en quelques heures. Résultats 90 jours après les perfusions de CTL 7 des 8 patients étaient encore vivants CTLs infusés de donneurs tiers ont été détectés dans 5 patients sur 6 jusqu’à 76 jours après la perfusion Aucun greffon Conclusion Notre approche de séparation offre une alternative rapide au traitement par CTL adoptif si les stratégies de traitement antiviral primaire échouent. Aucune étape d’expansion prolongée n’étant nécessaire, cette méthode peut être utilisée pour le traitement précoce de patients souffrant de maladies potentiellement mortelles. complications infectieuses

Aujourd’hui, la greffe de cellules souches hématopoïétiques allogéniques HSCT est utilisée comme traitement curatif des malignités leucémiques, des erreurs innées du métabolisme ou de la fonction immunitaire, et de certaines tumeurs solides [1, 2] La prise en charge de la greffe allogénique est associée à plusieurs complications sévères telles que greffe GVHD, rechute et infections potentiellement mortelles Epstein-Barr virus EBV, cytomégalovirus CMV et réactivations adénovirales sont des complications qui surviennent fréquemment après HSCT allogénique en raison d’un manque de contrôle des lymphocytes T qui résulte d’une immunosuppression étendue et d’une mauvaise immunité. reconstitution [3-5] Dans certains cas, l’infection par l’EBV peut également transformer les cellules B porteuses en une malignité appelée PTLD, maladie post-transplantaire lymphoproliférative, associée à un taux de mortalité élevé [6] Les lymphocytes T cytotoxiques Les CTL qui reconnaissent les antigènes viraux sont les plus importants mécanisme effecteur immunitaire pour contrôler les infections persistantes EBV, CMV, et adénoviraux Virus-spe Les CTL spécifiques sont facilement détectables dans le sang périphérique des porteurs sains, mais sont souvent absents ou supprimés chez les receveurs de greffe grâce aux médicaments immunosuppresseurs et à la thérapie de conditionnement, augmentant ainsi le risque de réactivation virale et de virémie. [5, 7, 8] Les patients séropositifs pour le CMV transplantés avec des donneurs séronégatifs pour le CMV courent un risque accru de mortalité liée à la transplantation, de maladie à CMV et de réactivations répétées du CMV [9] Pour la plupart des patients, la présence de l’ADN du CMV dans le plasma est traitée avec succès avec le ganciclovir ou le foscarnet. [11] Dans certains patients avec l’infection d’adenovirus, le cidofovir peut avoir un effet contrôlant [12] Howev Chez les patients atteints de HSCT allogénique gravement immunodéprimés, des traitements répétés par antiviraux sont souvent nécessaires car ils augmentent le développement de souches de virus pharmacorésistantes, bien que la mortalité globale due à la virémie pharmacorésistante après la greffe de CSH soit encore considérable [3, 13 Une autre approche de traitement est d’améliorer la réponse CTL spécifique du virus par transfert adoptif de CTL spécifiques du virus du donneur. En 2002, Einsele et al ont montré que cette approche était efficace pour la maladie CMV résistante après HSCT allogénique [14] la méthode standard de l’immunothérapie adoptive des lymphocytes T, la procédure est laborieuse et longue et il est souvent trop tard pour administrer la procédure au patient [14-17] En outre, après, par exemple, la transplantation de sang de cordon, un donneur est non disponible Nous et d’autres avons récemment mis au point de nouvelles méthodes de traitement des maladies virales menaçant le pronostic vital dans lesquelles des cellules T virales spécifiques sont sélectionnées ex vivo et directement infusées le patient En excluant les étapes d’expansion encombrantes in vitro, ces méthodes peuvent être utilisées pour traiter les patients en quelques jours plutôt qu’en quelques semaines [18-20] Dans cette étude, nous avons mis en œuvre cette nouvelle approche pour traiter les infections virales difficiles à traiter. adénovirus chez les receveurs de greffe ainsi que chez les nourrissons atteints d’une infection active avant la transplantation

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Les patients

Huit patients, 5 hommes et 3 femmes ont été inclus dans l’étude en raison d’une réponse insuffisante au traitement antiviral conventionnel ou d’une toxicité liée au médicament. L’étude a été approuvée par le comité régional d’éthique de Stockholm Sept patients ont été traités par HSCT entre 2009 et 2011 était un nourrisson présentant un déficit immunitaire combiné sévère, traité par SCID avant la greffe de cellules souches hématopoïétiques, afin de contrôler une infection sévère à CMV. Les caractéristiques des patients sont énumérées dans le tableau 1.

Tableau 1 Caractéristiques du patient Diagnostic de l’âge du patient Conditionnement Source du greffon GVHD Prophylaxie HLA Correspondance Sexe Genre donneur Sexe CMV Donneur EBV Donneur CMV Destinataire EBV Receveur CMV 1 59 Lymphome T Cy fTBI PBSCT Prograf® rapa 10/10 Mâle Mâle CMV 2 48 CMML Bu Cy PBSCT CyA MTX 10/10 Mâle Mâle CMV 3 5 Fanconi / MDS Grippe BM BM CyA Campath® 9/10 Femelle Mâle – – CMV 4 53 B-ALL Cy fTBI UCBT Cya préd 5/6 Femelle Femelle – – – CMV 5 28 T-ALL Cy fTBI PBSCT CyA MTX 10/10 Mâle Mâle CMV 6 05 SCID N / D N / D N / D N / D Masculin N / D N / D N / D N / D N / A Adeno 7 14 Pré B-ALL Cy FTBI UCBT Cya pred 4/6, 4/6 Homme Homme – – – EBV 8 17 AML Cy fTBI UCBT Cya pred 4/6 Femme Féminin – – Patient Age Diagnostic Conditionnement Greffe Source GVHD Prophylaxie HLA Match Patient Genre Donneur Genre CMV Donateur EBV Donneur CMV Recipien t EBV Récipient CMV 1 59 T-lymphome Cy fTBI PBSCT Prograf® rapa 10/10 Mâle Mâle CMV 2 48 CMML Bu Cy PBSCT CyA MTX 10/10 Mâle Mâle CMV 3 5 Fanconi / MDS Grippe Cy BM CyA Campath® 9/10 Femelle Masculin – – CMV 4 53 B-ALL Cy fTBI UCBT Cya préd. 5/6 Femelle Féminin – – – CMV 5 28 T-ALL Cy fTBI PBSCT CyA MTX 10/10 Mâle Mâle CMV 6 05 SCID N / A N / A N / A A N / A N / A N / D N / D N / A N / A Adeno 7 14 Pré B-ALL Cy FTBI UCBT Cya pred 4/6, 4/6 Mâle Mâle – – – EBV 8 17 AML Cy fTBI UCBT Cya pred 4/6 Féminin Féminin – – Abréviations: ALL, leucémie aiguë lymphocytaire; AML, leucémie myéloïde aiguë; B, cellule b; BM, moelle osseuse; Bu, busulphan; CMML, leucémie myélomonocytaire chronique; CMV, cytomégalovirus; Cy, cyclophosphamide; CyA, cyclosporine A; EBV, virus d’Epstein-Barr; Grippe, fludarabine; fTBI, irradiation corporelle totale fractionnée; MDS, syndrome myélodysplasique; MTX, méthotrexate; N / A, non applicable; PBSCT, greffe de cellules souches du sang périphérique; pred, prednisolone; le rapa, la rapamycine; SCID, déficit immunitaire congénital sévère; T, cellule T; UCBT, greffe de sang de cordon ombilicalView Large

Coloration par cytométrie en flux

Des cellules mononucléaires de sang périphérique 2 PBMC ont été lavées dans du PBS salin tamponné au phosphate et colorées avec le pentamère SLYNTVATL témoin négatif ou avec les pentamères HLA appropriés de ProImmune Ltd Oxford, UK pendant 20 minutes à température ambiante. Les cellules ont ensuite été lavées dans du PBS et colorées avec CD3 UCHT1- et CD8 RPA-T8 anticorps spécifiques de BD Bioscience San Jose, CA sur la glace et analysés sur un analyseur de tri cellulaire activé par fluorescence en utilisant le logiciel CellQuest BD Labware, Franklin Lakes, NJ

Tableau 2 Caractéristiques d’Infection Patient Virus Titer Réponse Statut 90 Jours Statut 1 An CTL Origine Donneur Infusé Cellules / kg Pureté des Cellules T% HLA Restriction Détectée Cellules Infusées d Indication CTL Immune Suppression Avant / Après Infusion CTL 1 Vivant Mort Donneur Frozen 08 × 104 70 HLA-A02 N / A Toxicité / CMV 2 Vivant Mort Donneur congelé 22 × 104 63 HLA-A02 N / A Toxicité / CMV 3 Vivant Vivant Mère 108 × 104 24 HLA-B07 14 Répondeur médiocre / CMV 4 / – Vivant vivant Fille 55 × 104 29 HLA-A02 – Répondeur médiocre / CMV 5 Alive Vivant Frère 27 × 104 40 HLA-B35 90 Répondeur médiocre / CMV 6 Vivant mort Mère 246 × 104 75 HLA-A02 7 Répondeur médiocre Rien Adeno 7 / – Mort Morte 31 × 104/17 × 104 90 HLA-A01 4 Répondeur médiocre / EBV 8 Alive Vivant Mère 18 × 104 41 HLA-A02 76 Mauvais répondeur Rien Patient Virus Titer Réponse Statut 90 Jours Statut 1 Année CTL Origine du donneur Cellules infusées / kg Pureté des lymphocytes T% HLA Restriction Détection des cellules perfuses d Indication des LTC Immunisation avant / après Infusion de CTL CMV 1 Alive Mort Donneur congelé 08 × 104 70 HLA-A02 N / A Toxicité / CMV 2 Vivant Mort Donneur congelé 22 × 104 63 HLA-A02 N / A Toxicité / CMV 3 Vivant Vivant Mère 108 × 104 24 HLA-B07 14 Répondeur médiocre / CMV 4 / – Vivant Alive Fille 55 × 104 29 HLA-A02 – Répondeur médiocre / CMV 5 Alive Alive Frère 27 × 104 40 HLA-B35 90 Répondeur médiocre / CMV 6 Vivant mort Mère 246 × 104 75 HLA-A02 7 Mauvais répondeur Rien Adeno 7 / – Morts mortes Mère 31 × 104/17 × 104 90 HLA-A01 4 Mauvais répondeur / EBV 8 Alive Vivant Mère 18 × 104 41 HLA-A02 76 Mauvais répondeur Rien Abréviations: CMV, cytomégalovirus; CTL, lymphocyte T cytotoxique; EBV, virus d’Epstein-Barr; HLA, antigène leucocytaire humain; N / A, non applicableVoir Grand

Préparation CTL

Lorsque du sang total a été utilisé comme source de préparation de CTL, 450 mL ont été prélevés du donneur dans un système de contenants de sang à quatre poches CPD / SAG-M Fenwal, La Châtre, France [21] Le sang du donneur a ensuite été dilué 1: 1 avec CliniMACS Tampon EDTA PBS / acide éthylènediaminetétraacétique Miltenyi Biotec GmbH, BergischGladbach, Allemagne et PBMCs séparés par centrifugation en gradient de densité Lymphoprep, Fresenius Kabi Norge AS ou séparés sur un gradient Ficoll sur les spectres Cobe, avant lavage dans CliniMACS PBS / EDTA tampon 4 fois Si le matériel de greffe congelé était disponible, les cellules ont été décongelées et lavées deux fois au tampon CliniMACS PBS / EDTA. Les cellules ont ensuite été colorées avec le pentamère HLA contenant un peptide marqué à l’allophycocyanine APC pendant 30 minutes suivies d’une incubation secondaire avec anti-APC magnétique. perles Miltenyi Biotec GmbH pendant 20 minutes sur glace Après le lavage, les cellules ont été passées à travers des colonnes LS Miltenyi Biotec GmbH La fraction positive, qui était composée de pentamères positives c les cellules ont été élues, lavées et analysées pour la pureté par cytométrie de flux. Tableau 2 Les cellules ont ensuite été diluées dans une solution saline avec du sérum AB humain à 10% et injectées par voie intraveineuse.

Analyse du chimérisme

En utilisant des répétitions courtes en tandem comme marqueurs polymorphes, une analyse du chimérisme a été réalisée pour différencier le donneur donneur, le receveur et le donneur de CTL [22] Après amplification PCR, les produits ont été analysés par électrophorèse capillaire sur un analyseur génétique 3130 Applied Biosystems, Foster City , CALIFORNIE

Quantification virale

La quantification de la présence d’ADN du CMV dans le plasma a été réalisée sur des échantillons de sang total en utilisant une méthode de PCR en temps réel [23] Pour l’EBV, une légère modification du PCR en temps réel a été utilisée pour quantifier l’ADN. En ce qui concerne l’ADN adénoviral, un test de PCR en temps réel mesurant le gène hexon dans le plasma ou le sérum a été utilisé [25]

RÉSULTATS

Les cellules T spécifiques du CMV peuvent être séparées du matériel de donneur congelé et utilisées pour la thérapie adoptive

Infections lymphocytaires du donneur Les DLI après transplantation ont été rapportés avec succès comme ayant un effet positif sur certaines rechutes malignes après HSCT [26, 27] Pour cette raison, le matériel de greffe résiduel est congelé et sauvé DLI a également été utilisé pour traiter les infections post-HSCT. le risque de GVHD, une sélection de lymphocytes T spécifiques de l’IDD est justifiée [28] Deux patients mâles présentant une présence d’ADN de CMV dans le plasma qui ne répondaient pas au traitement antiviral ont été traités avec des lymphocytes T spécifiques du CMV séparés du matériel DLI congelé. 1

Figure 1View largeTélécharger slideCytomegalovirus Les lymphocytes T spécifiques au CMV pour la thérapie adoptive peuvent être préparés à partir de donneurs congelés. Infusions de lymphocytes donneurs congelés Les DLI ont été décongelés et lavés avant la sélection positive des cellules marquées avec des pentamères HLA-A02 contenant NLV Sur la gauche, fréquences du pentamère CD8 Les lymphocytes T des lymphocytes T cytotoxiques et les patients avant et après la perfusion de CTL sont indiqués pour le CMV. Un patient 1 et un patient B 2 La fraction des cellules T CD8 dans les cellules mononucléaires totales du sang périphérique est indiquée sous chaque plot de tri cellulaire activé par fluorescence. le droit, les titres de CMV sont tracés en fonction des jours post-transplantation pour les deux patients Une ligne verticale en pointillés désigne le jour de la perfusion de CTL Abréviations: CMV, cytomegalovirus; CTL, lymphocyte T cytotoxique; pat, patientFigure 1View largeTélécharger slideCytomegalovirus Les cellules T spécifiques au CMV pour la thérapie adoptive peuvent être préparées à partir de donneurs congelés Les infusions de lymphocytes du donneur congelés DLI ont été décongelés et lavés avant la sélection positive des cellules marquées avec des pentamères HLA-A02 contenant du NLV. CMV Un patient 1 et un patient B 2 Une fraction de lymphocytes T CD8 dans les cellules mononucléaires totales du sang périphérique est indiquée sous chaque cellule triée par fluorescence. plot A droite, les titres en CMV sont reportés en fonction des jours post-transplantation pour les deux patients. Une ligne verticale en pointillés désigne le jour de l’infusion de CTL. Abréviations: CMV, cytomégalovirus; CTL, lymphocyte T cytotoxique; Le CMV 1 a été initialement traité avec le ganciclovir pour traiter la réactivation du CMV et la virémie 25 jours après la HSCT En raison d’une insuffisance rénale, le traitement a été interrompu au jour 29 mais a été repris à des doses plus faibles au jour 34 lorsque le patient avait des copies virales élevées. Malgré le traitement au ganciclovir, les copies virales ont continué d’augmenter et la décision a été prise d’infuser des cellules T spécifiques du virus extraites de DLI congelé. Le patient était sous immunosuppression continue avant et après perfusion de cellules T Aucune cellule T spécifique du CMV contre le HLA Les lymphocytes T ont été perfusés au jour 44. Au jour 70, le virus n’était plus détecté dans le sang et la fréquence des lymphocytes T spécifiques à l’épitope avait atteint 3% avec l’utilisation de coloration avec le peptide HLA-A2-restreint NLVPVATM pentamère Dans le patient CMV 2 la situation était analogue Ganciclovir a été arrêté en raison de la toxicité cérébrale avec confusion au jour 36 Fos Le carnet a également été essayé à partir du 71ème jour. La décision a été prise d’administrer des lymphocytes T spécifiques au jour 72 Des cellules spécifiques contre le peptide dérivé du CMV NLV ont été détectées dans le sang périphérique chez le patient préinfusion Au jour 100, aucune copie virale n’a été détectée dans le sang. la fréquence des lymphocytes T spécifiques de NLVPVATM restreints à HLA-A2 a augmenté jusqu’à 16% Figure 1B

Des cellules T spécifiques du CMV provenant de parents haplo-identiques peuvent être utilisées comme traitement chez des patients transplantés allogéniques

Après transplantation de sang de cordon ou en l’absence de matériel donneur supplémentaire, un tiers donneur de cellules T spécifiques du virus peut être une alternative pour le traitement des maladies virales fulminantes post-HSCT [29, 30] Chez 3 patients atteints d’infection active à CMV à la thérapie antivirale, les cellules T contre le peptide TPRVTGGGAM restreint à HLA-B7 Figure 2A, le peptide NLVPVATM restreint à HLA-A2 Figure 2B, ou le peptide HPVGEADYFEY restreint à B35 Figure 2C ont été perfusées

Figure 2View largeDownload slideCytomegalovirus Les cellules T spécifiques au CMV pour la thérapie adoptive peuvent être préparées à partir de parents haplo-identiques Les cellules mononucléaires du sang périphérique Les PBMC des lymphocytes T cytotoxiques Les donneurs de CTL ont été lavés avant sélection positive avec HLA-B07, HLA-A02 ou HLA-B35 pentamères contenant CMV pp65 peptides, respectivement, et billes magnétiques Les données des patients CMV 3, 4 et 5 sont montrées dans A-C, respectivement Les gauches montrent des tracés FACS de tri cellulaire activés par fluorescence pour les fréquences des cellules T pentamères dans les donneurs CTL et chez les patients avant et après la perfusion de CTL Chez les patients CMV 4 et CMV 5 pas de lymphocytes T CD3 ont été détectés désignés non applicable Fraction de lymphocytes T CD8 dans les PBMC totales est indiquée en dessous de chaque courbe FACS patient Dans les panneaux du milieu, les titres CMV sont relevés en jours après la transplantation Une ligne verticale en pointillés désigne le jour de la perfusion de CTL. Les panneaux de droite montrent les modèles de chimérisme des cellules provenant des sources indiquées; Patient avant la greffe de cellules souches hématopoïétiques HSCT, donneur HSCT, donneur CTL et cellules T spécifiques de CMV séparées chez le patient perfusion post-CTL Abréviations: CMV, cytomégalovirus; CTL, lymphocyte T cytotoxique; HSCT, greffe de cellules souches hématopoïétiques; pat, patient; N / A, non applicable Figure 2View largeDownload slideCytomegalovirus Les cellules T spécifiques au CMV pour la thérapie adoptive peuvent être préparées à partir de parents haplo-identiques Les cellules mononucléaires du sang périphérique Les PBMC des lymphocytes T cytotoxiques Les donneurs de CTL ont été lavés avant sélection positive avec HLA-B07, HLA-A02 , ou des pentamères HLA-B35 contenant des peptides pp65 de CMV, respectivement, et des billes magnétiques Les données des patients CMV 3, 4 et 5 sont montrées dans A-C, respectivement Les gauches montrent des tracés FACS de tri cellulaire activés par fluorescence pour les fréquences du pentamère T Cellules chez les donneurs de CTL et chez les patients avant et après perfusion de CTL Chez les patients CMV 4 et CMV 5, aucun lymphocyte T CD3 n’a été détecté désigné non applicable. Fraction de lymphocytes T CD8 dans le total des PBMC est indiquée sous chaque courbe FACS du patient. Les titres sont reportés en fonction des jours après la transplantation. Une ligne verticale en pointillés désigne le jour de l’infusion de CTL. Les panneaux de droite montrent les modèles de chimérisme des cellules provenant des sources indiquées; patient avant la greffe de cellules souches hématopoïétiques HSCT, donneur HSCT, donneur de CTL, et les cellules T spécifiques de CMV séparés dans la perfusion post-CTL patient Abréviations: CMV, cytomégalovirus; CTL, lymphocyte T cytotoxique; HSCT, greffe de cellules souches hématopoïétiques; pat, patient; S / O, sans objetPatient Le CMV 3 a eu une réactivation du CMV 25 jours après la HSCT. Il était aux jours 25-43 du foscarnet et le ganciclovir a été ajouté le jour 61. Il est resté positif pour le CMV dans le sang et la décision a été prise d’administrer CTL Elle a reçu des cellules T spécifiques au TPR détectables dans le sang. Les cellules T spécifiques du CMV ont été séparées, et un test de chimérisme a été effectué afin de déterminer l’origine des cellules T spécifiques du virus. Figure 2A Le patient n’avait pas de copies virales détectables dans le sang 28 jours après la perfusion de CTL Le CMV 4 avait une réactivation du CMV 20 jours après la GCSH avec des titres faibles et fluctuants allant de 1000 à 3000 copies sur 30 jours Ganciclovir a été toléré mais n’a pas réussi à éliminer la virémie Bien qu’aucune cellule CD3 n’ait été détectée les données non montrées au jour 35, la décision a été prise d’infuser des cellules T spécifiques de la fille du patient. Jusqu’à 8 semaines après l’échec de la perfusion des cellules T, aucune cellule T ayant la même spécificité peptidique que les cellules perfuses. L’analyse du chimérisme de la population totale de CD3 n’a montré que la présence du donneur HSCT d’origine. 90 jours après la perfusion de CTL Le patient CMV 5 a eu une réactivation du CMV le 27ème jour post-HSCT Il a commencé sur foscarnet, avec une bonne réponse initiale, bien qu’il ait été interrompu en raison d’une cystite hémorragique Le patient a été changé en ganciclovir; cependant, en raison des copies virales restantes, la décision a été prise d’infuser des cellules T spécifiques de son frère haplo-identique au jour 80 post-HSCT. Son immunosuppression n’a pas changé durant toute la période Douze semaines après la perfusion de CTL, le frère reste détectable par l’analyse du chimérisme Figure 2C Aucune virémie détectée 20 jours après la transfusion de CTL

Les cellules T spécifiques du CMV de la mère peuvent être utilisées pour traiter les nouveau-nés immunodéprimés

La CMV active est associée à un risque de décès excessivement élevé [31] Une transplantation de sang de cordon était prévue chez un patient CMV 6 à cause de SCID L’enfant a commencé à prendre du ganciclovir en raison d’un nombre élevé de copies d’ADN du CMV Aucun effet sur CMV Des niveaux d’ADN ont été observés après 2 semaines de traitement Pour diminuer la charge virale avant HSCT, la décision a été prise d’infuser des lymphocytes T spécifiques de CMV restreints par HLA-A2 pour lutter contre le peptide NLVPVATM restreint à HLA-A2. Le ganciclovir a été poursuivi pendant toute la période Le jour 1, des lymphocytes T spécifiques à la prétransplantation contre le même épitope ont été détectés chez le patient. L’analyse du chimérisme des lymphocytes T spécifiques à NLVPAVTM a révélé qu’une proportion d’environ 35% des cellules origine Le taux d’ADN du CMV dans le sang a été réduit de 768 000 à 70 000 copies / mL une semaine après la perfusion. Figure 3 Après la transplantation de sang de cordon ombilical sur, plus de surveillance pourrait être effectuée

Les cellules T spécifiques CMV peuvent être préparés à partir de parents haplo-identiques pour le transfert adoptif aux nouveau-nés immuno-compromis Les cellules mononucléaires du sang périphérique PBMC du lymphocyte T cytotoxique CTL donneur ont été lavés avant la sélection positive avec le pentamère HLA-A02 contenant NLV Le tableau de gauche montre des tracés FACS de fluorescence activés par fluorescence pour les fréquences des lymphocytes T pentamères dans le donneur CTL et chez le patient CMV 6 avant et après infusion de CTL. La fraction des lymphocytes T CD8 dans les PBMC totales est indiquée sous les tracés FACS Dans le panneau du milieu, les titres de CMV sont reportés sur plusieurs jours après la transplantation. Une ligne verticale en pointillés désigne le jour de la perfusion de CTL Le panneau de droite montre les modèles de chimérisme des cellules du patient avant la transplantation de cellules souches hématopoïétiques, le donneur de CTL cellules du patient après perfusion de CTL Abréviations: CMV, cytomégalovirus; CTL, lymphocyte T cytotoxique; Les cellules T spécifiques du CMV peuvent être préparées à partir de parents haplo-identiques pour un transfert adoptif à des nouveau-nés immunodéprimés. Les cellules mononucléaires du sang périphérique Les PBMC du lymphocyte T cytotoxique CTL donneur ont été lavées avant sélection positive avec HLA contenant du NLV. A02 pentamères et billes magnétiques Le panneau de gauche montre des tracés FACS de fluorescence activés par fluorescence pour les fréquences des lymphocytes T pentamères chez le donneur CTL et chez le patient CMV 6 avant et après infusion CTL. La fraction des lymphocytes T CD8 dans les PBMC totales est indiquée Tracés FACS Dans le panneau du milieu, les titres de CMV sont reportés sur plusieurs jours après la transplantation. Une ligne verticale en pointillés désigne le jour de perfusion de CTL Le panneau de droite montre les modèles de chimérisme des cellules du patient avant la transplantation de cellules souches hématopoïétiques. cellules T spécifiques du patient après perfusion de CTL Abréviations: CMV, cytomégalovirus; CTL, lymphocyte T cytotoxique; pat, patient

Des cellules T spécifiques de l’EBV et de l’adénovirus provenant de parents haplo-identiques peuvent être utilisées

Les infections à EBV et à adénovirus sont des complications infectieuses associées à l’état lymphopénique post-HSH [6, 32, 33]. Au 36ème jour après HSCT, l’adénovirus 7 a développé une infection adénovirale avec fièvre et 160 000 copies virales / ml de sang. Son traitement immunosuppresseur 5 mg / kg de cidofovir a été administré par voie intraveineuse une fois par semaine pendant 8 semaines. Malgré cela, sa fièvre a continué et les copies adénovirales dans le sang ont continué d’augmenter. La décision a été prise d’administrer des lymphocytes T spécifiques de l’adénovirus. Le patient était sous immunosuppression à faible dose pendant toute la phase. Le patient avait des lymphocytes T CD3 non détectables avant la perfusion. Au jour 4 après la perfusion, un petit nombre de lymphocytes T spécifiques du virus ont été détectés de manière transitoire. chimérisme, des lymphocytes T spécifiques du virus de la mère ont été détectés au jour 3, mais pas par la suite. Figure 4A En raison de opies, les lymphocytes T spécifiques du virus de la mère ont été perfusés une seconde fois 2 semaines plus tard. Aucune cellule T spécifique ou cellule T CD3 n’a été détectée après les données de perfusion non montrées, et le patient est décédé plus tard de l’infection adénovirale.

Figure 4View wideDownload slideEpstein-Barr virus EBV et adénovirus spécifiques T cellules pour la thérapie adoptive peuvent être préparés à partir de parents haplo-identiques Les cellules mononucléaires sanguines périphériques de donneur de lymphocytes T cytotoxiques T ont été lavées avant la sélection positive des cellules marquées avec GLCTLVAML- et CLGGLLTMV contenant Pour le patient 7, le panneau de gauche montre des tracés FACS de tri cellulaire activés par fluorescence pour les fréquences des lymphocytes T pentamères chez le donneur de CTL, chez le patient avant la perfusion de LTC, et 1 et 6 jours après la perfusion de CTL Dans le panneau du milieu, les titres d’adénovirus sont reportés sur plusieurs jours après la transplantation. Le jour de la perfusion de CTL est indiqué par une ligne verticale en pointillés. le donneur HSCT, le donneur CTL et les cellules T spécifiques de l’adénovirus séparées du patient 1 jour et 6 jours après CTL tran sfusion B Pour le patient EBV 8, le panneau de gauche montre les courbes FACS pour les fréquences des cellules GLC et CLG positives respectivement chez le donneur CTL et chez le patient avant et après infusion CTL. Dans le panel du milieu, les titres EBV sont relevés en jours après la transplantation Le jour de la perfusion de CTL est indiqué par une ligne verticale en pointillés Le panneau de droite montre les schémas de chimérisme des cellules du patient avant la transplantation, le donneur HSCT, le donneur de CTL et les cellules T spécifiques du GLC et du CLG Infusion de CTL [Figure 4B, panneau de droite Reproduit avec l’aimable autorisation de Springer Science Média d’affaires: & lt; Cancer Immunol Immunother 2010; 59: 473-7, Uhlin et al, fig1e>] Abréviations: CTL, lymphocyte T cytotoxique; EBV, virus d’Epstein-Barr; HSCT, greffe de cellules souches hématopoïétiques; pat, patientFigure 4View largeTélécharger lameEpstein-Barr virus EBV et cellules T spécifiques adénovirus pour la thérapie adoptive peuvent être préparés à partir de parents haplo-identiques Les cellules mononucléaires du sang périphérique de lymphocytes T cytotoxiques donneur de CTL ont été lavées avant sélection positive des cellules marquées avec GLCTLVAML- et CLGGLLTMV Pour le patient 7, le panneau de gauche montre des tracés FACS de tri cellulaire activés par fluorescence pour les fréquences des lymphocytes T pentamères chez le donneur de CTL, chez le patient avant la perfusion de CTL. Le jour de la perfusion de CTL est indiqué par une ligne verticale en pointillés. Le panneau de droite montre les profils de chimérisme des cellules du patient avant la transplantation de cellules souches hématopoïétiques. HSCT, le donneur HSCT, le donneur CTL, et les cellules T spécifiques adénovirus séparés du patient 1 jour et 6 jours après Pour le patient EBV 8, le panneau de gauche montre les courbes FACS pour les fréquences des cellules GLC et CLG positives respectivement chez le donneur de CTL et chez le patient avant et après la perfusion de CTL. Dans le panel du milieu, les titres EBV sont tracés Le tableau de droite montre les schémas de chimérisme des cellules du patient avant la transplantation, le donneur de HSCT, le donneur de CTL et les cellules T spécifiques de GLC et de CLG séparées du patient. Patient après la perfusion de LTC [Figure 4B, panneau de droite Reproduit avec l’aimable autorisation de Springer Science Média d’affaires: & lt; Cancer Immunol Immunother 2010; 59: 473-7, Uhlin et al, fig1e>] Abréviations: CTL, lymphocyte T cytotoxique; EBV, virus d’Epstein-Barr; HSCT, greffe de cellules souches hématopoïétiques; pat, patient Le patient EBV 8 a déjà été traité avec des LTC spécifiques du peptide GLCTLVAML HLA-A2 pour lutter contre le lymphome EBV de sa mère. Ces lymphocytes T sont restés jusqu’à 76 jours après la perfusion [29] Au 305ème jour post-HSCT, le patient est revenu Fièvre a été détectée dans le sang, le côlon et les amygdales. Aucun CTL maternel n’a été détecté. En raison de suspicion de progression de la maladie, la décision a été prise d’administrer à nouveau des lymphocytes T spécifiques de l’EBV à la mère. Sa patiente était séronégative dans le sang 2 semaines après la perfusion. Avec le chimérisme, les cellules infusées de la mère ont été détectées presque 2 mois après la perfusion. Figure 4B

DISCUSSION

[35, 38] Nous nous sommes concentrés ici sur une autre approche, basée sur l’infusion d’un petit nombre de lymphocytes T directement séparés et sur leur potentiel d’expansion in vivo ultérieure après la perfusion dans le plasma. receveur [29] La première approche dans laquelle une stratégie similaire a été utilisée a été décrite par Cobbold et al [39]; 9 patients avec réactivation du CMV ont été traités avec des cellules du donneur HSCT d’origine Récemment, Schmitt et al ont rapporté 2 cas traités avec des CTL spécifiques au CMV sélectionnés par streptamère [20] Le besoin de mesures rapides est accompli avec cette approche, et la thérapie CTL peut être mis en œuvre avec succès non seulement pour des mesures préventives, mais aussi pour traiter les personnes présentant des symptômes potentiellement mortels Cette stratégie de traitement peut facilement être adoptée en complément de la thérapie virale standard par de plus petites cliniques sans charge économique considérable. être effectuée en utilisant seulement 400 ml de sang total, ce qui est contraire à la leucophorèse, rendant la procédure sûre et simple pour le donneur Dans cette étude, nous avons traité 8 patients avec des infections causées par 3 virus divers et des histoires cliniques différentes avec une procédure similaire. la méthode est robuste et peut être une alternative pour les patients en situation de vie en danger Dans ces types de situations cliniques, il est souvent difficile de prouver l’efficacité réelle des lymphocytes T perfusés en raison de stratégies thérapeutiques supplémentaires, de modifications de l’immunosuppression et de la clairance naturelle des infections [29, 30, 38]. Dans cette étude, nous montrons des preuves circonstancielles En outre, 6 des 8 patients ont montré une diminution des titres viraux dans les 2 semaines suivant la perfusion de CTL Dans certains cas, comme le CMV 2 du patient, des cellules T spécifiques du virus ont été détectées par chimérisme. ont été détectés avant la perfusion de CTL Nous n’avons pas pu déterminer la fonctionnalité de ces cellules, ce qui rend difficile la distinction entre leur effet et celui des cellules perfuses. Cependant, un effet supplémentaire peut être spéculé. pour 7 des 8 patients est remarquable Bien que seulement 4 patients vivaient 1 an après la perfusion, aucun n’a eu des problèmes supplémentaires en raison de la maladie virale originale Cependant, le 4 les patients sont morts pour d’autres raisons 1 an plus tard souligne la nécessité d’une utilisation préventive plutôt que thérapeutique de l’immunothérapie post-génique post-allogénique HSCTF ou EBV, plusieurs chercheurs ont identifié des facteurs de risque après HSCT allogénique [6, 13, 33] utilisé pour inhiber la réactivation de l’EBV viral et pour prévenir ou traiter les PTLD [40, 41] Ceci est également vrai pour l’utilisation de médicaments antiviraux comme traitement préventif des infections à CMV et adénovirus [12, 42] Théoriquement, cette approche devrait être possible subissant HSCT allogénique avec des facteurs de risque pour l’un des 3 virus-EBV, CMV et les infections adénovirales Dans une majorité de patients atteints de HSCT, les cellules T transférées adoptivement sont nécessaires pendant la phase où l’immunosuppression se produit. les cellules sont attractives En théorie, les lymphocytes T mésappariés au CMH, en raison du milieu immunodéprimé, resteront pour combattre le pathogène Le nouveau système immunitaire de l’individu à récupérer et à prendre en charge Lorsque le patient devient immunocompétent, les cellules T haplo-identiques seront rejetées Ceci est en accord avec notre observation que seule la détection transitoire des cellules T est possible chez la plupart des patients. que la fonction de CTL perfusée est altérée par l’immunosuppression en cours Tacrolimus FK506 et la cyclosporine inhibent à la fois la prolifération et la fonction des CTL [43] Pour résoudre ce problème, plusieurs groupes ont étudié la possibilité de produire des CTL spécifiques au virus. inhibiteurs [44, 45] Notre approche pourrait bénéficier de cette stratégie supplémentaire car certains de nos patients restaient sous immunosuppression. L’état de différenciation des lymphocytes T perfusés n’a pu être déterminé à partir de cette étude. Des études ont montré que la longévité in vivo des lymphocytes T perfusés peut être en partie dépendant du profil de la mémoire [46] En outre, des données récentes ont également démonstra En gardant cela à l’esprit, la préanalyse de paramètres de différenciation comme celui-ci sur le produit de perfusion peut être utile à la fois pour prédire le résultat du transfert de cellules T adoptives et pour choisir En conclusion, l’approche de séparation décrite ici offre une alternative peu coûteuse et rapide pour la séparation et la thérapie CTL adoptive si les stratégies de traitement primaire telles que le traitement antiviral échouent. La technique n’impliquant pas d’étapes d’expansion prolongées in vitro, elle peut facilement être utilisée pour traiter les patients souffrant de maladies potentiellement mortelles

Remarques

Soutien financier Cette étude a été soutenue par la Société suédoise de lutte contre le cancer JM, le Conseil de recherche suédois MU, JM, la Société suédoise de recherche médicale MU et le Conseil du comté de Stockholm. M Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit signalé Formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Les conflits que les éditeurs jugent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués

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