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Élucidation de nouvelles interactions de liaison avec la protéine Tsg101 humaine en utilisant des ligands de peptides dérivés du VIH-1 Gag-p6 modifiés

Historiquement, de grandes composantes du développement thérapeutique ont été dans le dernier cas où l’on peut tirer parti des fentes de fixation des substrats bien définies ou des mécanismes catalytiques.1 Récemment, le ciblage des interactions protéiques (IPP) protéiques a acquis une plus grande reconnaissance2. impliquent généralement des contacts sur des surfaces étendues et relativement plates, il peut sembler contre-intuitif que de petites molécules ou peptides puissent fonctionner comme des antagonistes de liaison efficaces. Cependant, des composants significatifs de l’énergie PPI de liaison totale sont souvent dérivés d’un nombre limité de résidus protéiques localisés dans un point chaud bien défini &#x0201c ” régions3. Cela permet la possibilité d’une inhibition globale efficace de l’IPP par des agents relativement petits, qui peuvent tirer profit des interactions de haute affinité au sein de ces régions de points chauds.4 Pour cette raison, le développement des inhibiteurs de l’IPP est devenu un domaine de recherche extrêmement actif. Le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) est une maladie dévastatrice causée par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) qui, après près de 30 années de recherche, a vendu au total 25 médicaments approuvés par la FDA pour traitement.7 Ces agents sont soit dirigés contre des enzymes clés dans le cycle de vie viral, tels que la protéase, la transcriptase inverse et l’intégrase, ou inhibent l’entrée virale. Comme l’a récemment montré l’intégrase, le développement d’enzymes mutantes pharmacorésistantes donne un sentiment d’urgence à la poursuite de la recherche de nouveaux modes d’inhibition de la réplication du VIH-1.8Parce que la production efficace d’un nouveau virus nécessite des interactions spécifiques entre protéines virales et humaines, l’inhibition pharmacologique des IPP appropriés représente de nouvelles possibilités potentiellement attrayantes pour le développement thérapeutique anti-VIH-1.9 Une cible reconnue de ce type est la protéine cellulaire humaine codée par le gène de susceptibilité tumorale 101 (Tsg101), qui est un composant de l’endosome hôte. voie de tri, dont l’interaction avec le domaine C-terminal p6 de la protéine Gag virale naissante est nécessaire pour l’assemblage viral et le bourgeonnement.10 − 13 La liaison de Gag au domaine de la variante ubiquitine E2 (TsV101) dépend d’un Pro -Thr-Ala-Pro (“ PTA-P ”) motif avec la région p6, et le blocage de cette interaction entraîne des effets antiviraux.14 − 16 L’importance de t La séquence P-T-A-P relativement confinée à l’interaction Tsg101 − Gag indique qu’il pourrait s’agir de “ point ” dans la nature et favorable au développement d’inhibiteur. En accord avec cette notion, une structure de solution de RMN précédente du peptide dérivé de p6 “ P1-E2-P3-T4-A5-P6-P7-E8-E9 ” lié à Tsg101 montre que le peptide se lie dans un sillon, les résidus P3-T4-A5-P6 établissant le plus grand contact.17 Bien que cette séquence puisse servir de point de départ pour le développement de l’inhibiteur, son affinité est hors de portée utile ( Kd > 50 μ M), et ses interactions de liaison, telles qu’indiquées par la structure de la solution RMN, ne sont pas suffisamment bien définies pour permettre une conception ” Par conséquent, nous avons entrepris une approche empirique du développement du ligand en effectuant des modifications structurelles à chaque résidu du peptide. Ceci a été fait de manière non biaisée en utilisant des dérivés d’acides aminés non codés qui ont été synthétisés par une diversification en phase solide à base d’oxime. Le protocole impliquait l’insertion de groupes aminooxy à chaque résidu du peptide parent 1 (figure ​ (figure 1) .1). Ceux-ci ont ensuite servi de “ poignées ” pour l’élaboration de groupes fonctionnels par ligation à l’oxime en utilisant des bibliothèques d’aldéhydes. 18 − 20 Il a été trouvé que, bien que les modifications dans la région “ T4-A5-P6 ” l’inattendu, étant donné que, sur la base de la structure de la solution RMN rapportée précédemment, le résidu P3 remplit une fonction plus mineure en interagissant avec une poche peu profonde sur la surface de la protéine.17Figure 1Structures de peptides discutés dans le texte.Comme indiqué dans la présente, pour comprendre la base structurelle pour l’amélioration de l’affinité observée, nous avons résolu la structure de coocristaux Tsg101 des deux analogues les plus puissants (2 et 3, Figure 1), 1 ), qui complète notre récent rapport sur la structure cristalline de 1 lié à Tsg101.21 Avant d’entreprendre ce travail, les seules données structurelles liées aux interactions de Tsg101 et de peptide ont été dérivées des études de la solution de RMN.16,17 Dans notre étude actuelle , nous trouvons que les squelettes peptidiques de 2 et 3 sont superposables à ceux du parent 1.20 Les peptides 2 et 3 contiennent des substituants 3,4-diméthoxybenzyle sur les poignées (4R) -aminooxy de leurs cycles pyrrolidine P3 (liaison par des liaisons oxime et amide , respectivement). Les structures de cocristaux clarifient la base de l’amélioration de l’affinité induite par la fonctionnalisation en position P3. Les nouvelles interactions de liaison sont clairement définies et s’étendent de façon significative au-delà de ce qui serait possible à partir du résidu parent P3 non modifié (figure ​ (figure2) .2). Le groupe diméthoxybenzyle de 2 rend les contacts de van der Waals avec des parties non polaires des chaînes latérales de T-56, P-71 et K-90, tandis que la liaison oxime entre en contact avec la chaîne latérale de T-58. Le groupe 3-méthoxy accepte une liaison hydrogène d’une molécule d’eau qui est à son tour liée à l’oxygène carbonyle de P-91. Cependant, aucune liaison hydrogène directe n’est formée avec la protéine Tsg101. La liaison aminooxy dans 3 positions son groupe diméthoxybenzyle différemment de 2, de sorte que les anneaux benzyl sont tournés à environ 75 ° l’un par rapport à l’autre, et les positions atomiques correspondantes sont séparées de 2 à 10 &#x000c5 ;. Le résidu T-56 est le seul point de contact commun partagé avec 2. Des contacts uniques sont faits avec la partie aliphatique de K-36 et le C α de G-57. L’oxygène carbonyle de la liaison aminooxy forme une liaison hydrogène avec une molécule d’eau, mais aucune liaison hydrogène directe n’est établie avec la protéine. Un thème commun dans ces deux structures est que les groupes diméthoxybenzyle interagissent face à face avec une surface large et relativement plate et non polaire formée par la face exposée du système de feuilles antiparallèles Tsg101 (Figure 22). Figure 2 Structures cristallines de peptides liés à Tsg101 (a) Superposition du peptide 1 de type sauvage (jaune, PDB n ° 3OBU), du peptide 2 (cyan) et du peptide 3 (magenta). (B) Liaison du peptide 2 montrant les résidus clés interagissant avec le groupe 3,4-diméthoxybenzyloxime … Les données ci-dessus suggèrent que la surface de liaison nouvellement identifiée pourrait accueillir des interactions de liaison Tsg101 supplémentaires grâce à l’utilisation de fonctionnalités P3 plus étendues.Pour explorer cette possibilité, nous avons préparé plusieurs polycycliques oximes contenant des aryles (5 − 7, tableau 1) qui étaient censées offrir de plus grandes interactions avec la surface de liaison (Figure ​ (Figure 33) .22 − 24 Examen des valeurs IC50 déterminées en utilisant une anisotropie de fluorescence (FA ) qui a mesuré la capacité des peptides à entrer en compétition avec un variant du peptide 2 marqué au FITC (voir les informations de support) a montré que les affinités de liaison des peptides 5 étaient jusqu’à 5 fois plus élevées que celles des parents 2. Ces résultats indiquent qu’il existe une latitude significative dans la fonctionnalité qui est compatible avec la liaison dans cette région.Figure 3Exemples d’interactions de liaison d’oxime dans la région de liaison P3 nouvellement identifiée des peptides 5 (cyan), 6 (rouge) et 7 (vert ) par rapport au parent 2 (jaune). Se référer aux références (22) et (23). Tableau 1Tsg101 Affinités de liaison des peptides contenant de l’oxime polycyclique P3 Une indication plus pertinente d’affinité a été obtenue en mesurant la capacité des peptides à inhiber la liaison de Tsg101 à la protéine p6. A cette fin, des expériences de résonance plasmonique de surface ont été réalisées en utilisant la GST glutathion S-transférase (GST) ou GST-p6 capturée sur des puces d’anticorps anti-GST, avec la protéine Tsg101 en solution soit seule soit en présence de concentrations croissantes de peptides 2 ou 6 (voir les informations de support). A partir de la quantité de protéine Tsg101 liée à la protéine p6, les valeurs de IC50 ont été calculées pour être de 72 et 12 μ M pour les peptides 2 et 6, respectivement. En accord avec les tests de compétition FA, le peptide 6 présente une affinité de liaison Tsg101 environ 6 fois plus élevée que le peptide parent 2. Alors que les interactions de P3 décrites ci-dessus se limitent principalement à la surface de la protéine, la précédente le nonapeptide PEPTAPPEE lié à Tsg101 a indiqué que le résidu P6 se ​​lie dans une poche coincée entre les cycles aromatiques de Y-63 et Y-68 artério-sclérose. Cette interaction rappelle la reconnaissance des séquences de polyproline par les domaines WW et SH3.17 Nos cocristaux actuels apportent une nouvelle compréhension significative de cette poche et de son utilité potentielle pour exploiter des interactions de liaison plus étendues.Ce qui ressort de nos nouvelles données est que la liaison de l’anneau pyrrolidine P6 entre les résidus Y-68 et F-142 montré par la structure RMN définit simplement les régions supérieures d’une poche beaucoup plus profonde. Les parois inférieures de cette poche forment une cavité cylindrique délimitée par Y-63 et P-139. La profondeur de la poche est déterminée par le résidu V-61, dont le groupe isopropyle à chaîne latérale définit sa limite inférieure (figure ​ (figure 4) .4). La géométrie de cette poche est cohérente avec la structure et les données de relation d’activité (SAR) que nous avions précédemment observées. Par exemple, l’introduction d’une variété de dérivés d’oxime à partir de la position 4 du cycle pyrrolidine P6 a abouti à abroger uniformément l’affinité de liaison20. Il est maintenant évident que dans chaque cas la fonctionnalité ajoutée était trop large ou trop longue pour être accommodée. dans la poche. Dans une autre étude, nous avons examiné si les structures de type glycérine N-substituée pouvaient remplacer efficacement le résidu P6.25 Ce travail était basé sur l’observation précédente que les NSG peuvent fonctionner comme substitut Pro de haute affinité en remplissant plus complètement les poches de liaison. La plus haute affinité obtenue dans notre étude précédente (augmentation d’environ 5 fois par rapport au parent de référence contenant P6) 26 était avec l’analogue de butylhydrazone tel que décrit dans le peptide 4. (Figure ​ (Figure 11) .28 En superposant la chaîne latérale “ CH3 − CH2 − CH2 − C = N − ” de ce mimétique NSG sur la pyrrolidine P6 anneau du peptide parent 2, il est maintenant évident que la chaîne latérale n-butyle s’étend bien dans la poche de liaison P6 nouvellement définie (Figure ​ (Figure4) .4) .Par conséquent, les nouvelles données de cristal de notre étude actuelle à la fois clarifier les données de liaison antérieures empiriquement dérivées et pro guide de guidage pour la conception de nouveaux analogues.Figure 4Pro-6 poche de liaison de la structure de coocristal de Tsg101 & 2 x rendu en tant que potentiel de surface électrostatique. (a) Regard vers le bas dans la poche montrant le positionnement des résidus Pro-6 et Pro-7. (b) La même vue que dans une suppression suivante de … En conclusion, nous rapportons ici des données cristallines de ligands complexés au domaine UEV de la protéine Tsg101 humaine qui identifient de nouvelles interactions de liaison provenant des résidus critiques P3 et P6 du motif de reconnaissance canonique PTAP. La région proximale P3 est constituée d’une topologie de surface étendue. Comme illustré par plusieurs analogues préparés dans le cadre de la présente étude, la liaison dans cette région peut être exploitée par l’utilisation de fonctionnalités aromatiques ou polycycliques. En revanche, la poche de liaison P6 est étroite, profonde et bien définie et peut fournir des opportunités pour améliorer à la fois l’affinité de liaison et la sélectivité. Cette information pourrait être utile dans la conception d’antagonistes de liaison de Tsg101 de plus haute affinité.

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