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Découverte d’une benzo [e] pyrimido- [5,4-b] [1,4] diazépin-6 (11H) -one en tant qu’inhibiteur puissant et sélectif de la grande MAP Kinase 1

Les protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK) sont des composants cruciaux des cascades de signalisation qui régulent de nombreux processus physiologiques.1,2 Quatre voies MAPK ont été identifiées jusqu’à présent, y compris la kinase 1/2 régulée par le signal extracellulaire (ERK1 / 2), la kinase c-Jun-amino-terminale (JNK), p38 et BMK1.2. En tant que nouveau membre BMK1 est activé par une grande variété de stimulants mitogènes et de stress.3 − 6 Un lien récemment rapporté entre les niveaux anormaux d’expression de BMK1 et le cancer a considérablement augmenté l’intérêt pour cette voie de signalisation.7 La dérégulation de la voie BMK1 a Il a été montré que ce gène est associé à diverses propriétés malignes des cancers humains, notamment le potentiel métastatique accru des cellules cancéreuses de la prostate, la croissance maligne soutenue des carcinomes mammaires surexprimés par ErbB2 et la chimiorésistance des cellules cancéreuses du sein10. inhibiteurs de BMK1 et de sa kinase amont MEK5, ((Z) -3 – (((3- ((diméthylamino) méthyl) -phenyl) amino) – (phényl) méthylène) -2-oxoindoline-6-carboxamide (BIX02188) et (Z) -3 – (((3 – ((diméthylamino) méthyl) phényl) amino) (phényl) -méthylène) -N, N-diméthyl -2-oxoindoline-6-carboxamide (BIX02189)), ont été rapportés (Figure 11) (Figure 11) .11 Par conséquent, le développement d’inhibiteurs puissants et sélectifs de petites molécules BMK1 pour l’étude et la validation de la voie BMK1 en tant que Dans cette lettre, nous rapportons la conception et la synthèse de nouveaux composés pour explorer la structure de la structure et la relation d’activité (SAR) de BMK1 en utilisant un 2-amino pyrido [2,3- d] modèle de pyrimidine. Les cycles itératifs de la chimie médicinale et l’évaluation biologique de ces composés ont conduit à la découverte de 11, 18 et 21 inhibiteurs puissants et sélectifs de BMK1. Les efforts pour identifier les inhibiteurs d’une nouvelle cible kinase commencent souvent par un criblage d’inhibiteurs Nous avons initié notre effort de chimie en utilisant une petite bibliothèque de composés contenant une matrice de pyrido [2,3-d] pyrimidine. Le noyau de pyrido [2,3-d] pyrimidine peut être classé comme un échafaudage privilégié en ce qui concerne le ciblage du site ATP des kinases. Des exemples d’inhibiteurs de kinases contenant cet échafaudage central comprennent le BI-2536, un inhibiteur sélectif de la famille des poloïdes (PLK1, PLK2 et PLK3) 13,14 et 2 – ((3,5-difluoro-4-hydroxyphényl) -amino) – 8-isopentyl-5,7-dimethyl-7,8-dihydropteridin-6 (5H) -one (BI-D1870), un inhibiteur de RSK.15Utilisant l’information glanée à partir de ces exemples, nous avons conçu la kinase potentielle chimiotypes inhibiteurs I et II en élargissant le cycle pyridone à 6 membres de BI-2536 à un anneau de lactame à 7 membres (figure ​ (figure2) .2). Une voie de synthèse efficace en quatre étapes a été développée pour permettre la synthèse de plusieurs composés (4, 5, 10 et 11) dérivés des échafaudages I et II. La synthèse de 4 et 5 est décrite dans le schéma 1. D’abord, la 2,4-dichloro-5-nitropyrimidine a été mise à réagir avec du chlorhydrate de (S) -méthyl 2- (pyrrolidin-2-yl) acétate en utilisant de la diisopropyléthylamine comme base à température ambiante. pour donner le produit d’amination 1 avec un rendement modéré. Cette réaction a été suivie d’une réduction à médiation par le fer de 1 et d’une cyclisation in situ dans l’acide acétique à 50 ° C pour donner l’intermédiaire 2 à 7 membres du lactame avec un bon rendement. Le composé 5 a été obtenu par méthylation de 2 et suivi d’une amination médiée par le palladium de 3 avec de la 2-méthoxy-4- (4-méthylpipérazin-l-yl) -benzénamine. De manière similaire, le composé 4 a été synthétisé via une amination médiée par le palladium de l’intermédiaire 2. Figure 2 Expansion de l’échafaudage de pyrido [2,3-d] pyrimidine.Schéma 1Synthèse de 2-amino-7a, 8,9,10-tétrahydro-5H-pyrimido [5, 4-b] pyrrolo [1,2-d] [1,4] diazépin-6 (7H) -one 4 Similairement, 10 et 11 ont été synthétisés en utilisant l’ester éthylique N-méthyl anthranilique 6 comme matière de départ avec des rendements plus élevés (Schéma 2 Synthèse de la 2-amino-5,11-diméthyl-5H-benzo [e] pyrimido [5,4-b] [1,4] diazépine-6 ​​(11H) -one. Ces quatre composés ont été criblés contre un panel diversifié. de 402 kinases (Ambit KINOMEscan) en utilisant un test de liaison de compétition ATP-site in vitro à une concentration de 10 μ M.16,17 Compte tenu de la nature générique du motif d’interaction charnière dérivé de pyrimidine, nous avons été surpris de découvrir que ces composés présentaient des profils très sélectifs (voir les informations de support pour les données complètes de profilage). Les kinases qui présentaient un déplacement supérieur à 95% à partir d’un ligand immobilisé par les composés 10 et 11 sont listées dans le tableau 1.Tableaux 1Kinase Hits pour 10 et 11Par raison de notre intérêt pour la voie de signalisation BMK1, nous avons été attirés par l’effet d’inhibition La mesure des constantes de dissociation a révélé que le composé 11 présentait une bien meilleure affinité envers BMK1 avec une constante de dissociation mesurée (Kd) de 19 nM, alors que 10 possédait un Kd de 670 nM. Les autres cibles kinases puissamment inhibées par 11 étaient DCAMKL1 (Kd = 1,2 nM), DCAMKL2 (Kd = 10 nM), GAK (Kd = 450 nM), TNK1 (Kd = 29 nM) et TNK2 (Kd = 440 nM).Le score de sélectivité KINOMEscan (S5) calculé à un seuil de 5% du témoin diméthylsulfoxyde (DMSO) pour 11 est de 0,035 (14 sur 402 kinases) est comparable à celui calculé pour BI-2356 (S5 = 0,025, 9 sur 353) qui représente un haut niveau de sélectivité.18 Ensuite, nous avons examiné l’activité inhibitrice contre BMK1 cellulaire en mesurant la capacité des composés à inhiber l’autophosphorylation stimulée par le facteur de croissance épidermique (EGF) de BMK1 dans des cellules HeLa. Les données cellulaires ont démontré que 11 (mais pas 10) inhibaient significativement l’autophosphorylation de BMK1 à une concentration de 1 μ M. Ces résultats cellulaires sont cohérents avec les données biochimiques d’envergure, ce qui révèle que 11 est un plomb prometteur ayant la capacité d’inhiber BMK1 à la fois in vitro et dans les cellules.Utilisant 11 comme un plomb, le DAS pour le 2-amino-5,11- On a exploré les diméthyl-5H-benzo [e] pyrimido [5,4-b] [1,4] diazépin-6 (11H) -ones en utilisant l’inhibition de l’autophosphorylation de BMK1 dans les cellules HeLa comme lecture. Les cellules HeLa ont été privées de sérum pendant la nuit, suivi d’un traitement avec des inhibiteurs pendant 1 h. Les cellules ont ensuite été stimulées avec le facteur de croissance épidermique (EGF, 20 ng / mL) pendant 17 min, et l’activation de BMK1 a été détectée par un retard de mobilité.19 Nous avons d’abord exploré la position 2 de cet échafaudage. -méthoxy-4-substituants anilines (tableau 2). L’introduction de groupes 4-hydroxyl-pipéridin-1-yl, pipérazin-1-yle et 4- (4-méthylpipérazin-1-yl) pipéridin-1-yle à la position 4 de la 2-méthoxy aniline aboutit à des composés 12, 14 et 15, respectivement. Ces modifications ont toutes donné des composés possédant des activités similaires (tableau 2). Les composés 13 et 16 contenant des substituants avec des groupes morpholino et 1-méthylpipéridin-4-yle, respectivement, présentaient de légères diminutions d’activité. La substitution du groupe 2-méthoxy (11) par un groupe méthyle (17) conduit à une forte diminution de l’activité, tandis que le composé 2-éthoxy substitué 18 conserve une activité similaire. Ces résultats indiquent que le groupe 2-alkyloxy contribue de manière significative à la puissance globale de cette série d’analogues. Lorsque la 2-méthoxy-4- (4-méthylpipérazin-l-yl) -aniline a été remplacée par la 4-sulfonamideaniline, le composé résultant (19) était moins efficace. La substitution avec divers amides en position 4 a conduit à la synthèse des composés 20 et 21 présentant la meilleure activité dans cet ensemble de composés vers intestinaux. Le tableau 2SAR de la fraction 2-amino pour BMK1We a ensuite étudié les effets de la modification du N. -substituant (R3) de l’acide anthranilique et du noyau aryle (R4) (tableau 3). Les N-substituants (R3) allant du méthyle, de l’éthyle, de l’isopropyle au cyclopentyle sont exemplifiés par 11, 23, 24 et 25, et tous ont conservé une activité similaire suggérant une tolérance pour une élaboration plus poussée à cette position. Il semble y avoir une tolérance limitée à la substitution sur le cycle aryle de l’acide anthranilique, les analogues 5-méthyl, 4-fluoro, 5-chloro et 4-chloro (respectivement 26, 27, 28 et 29) perte d’activité. Alors que ces analogues pourraient suggérer une tolérance limitée pour l’élaboration ultérieure du cycle aryle, des modifications aux positions correspondantes d’autres échafaudages de kinase ont permis l’accès à une poche de liaison hydrophobe supplémentaire à la suite d’un passage à la conformation DFG-out.20,21 une enquête sera nécessaire pour examiner si “ type-II ” On peut accéder aux inhibiteurs de BMK1 par cette approche. Tableau 3SAR des substituants de la fraction acide anthranilique pour BMK1L’exploration SAR du 2-amino-5,11-diméthyl-5H-benzo [e] pyrimido [5,4-b] [1, 4] de la diazépine-6 ​​(11H) -one échafaud a révélé que la substitution N-méthyle à la position lactame (R1), le groupe 2-méthoxy de l’aniline 4-substitué, et l’absence de substituants (R4 = H) sur le cycle aryle de l’acide anthranilique étaient des caractéristiques structurelles clés requises pour obtenir une activité inhibitrice cellulaire puissante contre BMK1. Les deux composés les plus actifs 11 et 21 ont inhibé l’autophosphorylation de BMK1 induite par EGF avec des valeurs CI50 cellulaires submicromolaires de 0,19 ± 0,04 et 0,13 ± Pour une évaluation préliminaire de l’activité antiproliférative de ces nouveaux inhibiteurs de la kinase BMK1 contre les lignées cellulaires cancéreuses, 11 ont été comparés à un panel de 252 lignées cellulaires cancéreuses qui représentent divers types de tumeurs (voir les Informations à l’appui pour une liste détaillée). Ensuite, le composé le plus actif 21 a été testé dans le sous-ensemble de lignées cellulaires cancéreuses qui présentaient plus de 50% d’inhibition de la croissance cellulaire à une concentration de 5,0 « (tableau 4). Ces lignées cellulaires sélectionnées étaient sensibles à l’activité inhibitrice de croissance de 21 mais à des degrés différents.La plupart des lignées cellulaires sélectionnées présentaient des valeurs EC50 dans la gamme micromolaire à un chiffre compatible avec la signalisation BMK1 contribuant à la prolifération des lignées cellulaires cancéreuses mais des composés plus puissants sont nécessaires pour établir quelle corrélation existe entre l’inhibition de l’autophosphorylation BMK1 et l’activité antiproliférative.8 &#x02212 10 Activité antiproliférative de 21 contre un panel varié de lignées cellulaires cancéreuses sélectionnées Les propriétés pharmacocinétiques de 18 et 21 ont également été évaluées après administration intraveineuse et orale chez le rat et la souris, respectivement. Ces études ont démontré que 18 et 21 présentent des propriétés pharmacocinétiques favorables avec un T1 / 2 de 2,0 et 2,6 h, une ASC de 903 et 7871 h · ng / mL, et% F de 68,6 et 86,6, respectivement (Tableau 5). 5 Les paramètres pharmacocinétiques de 18 et 21aInhibiteur 18 ont été utilisés comme outil “ ” L’efficacité in vivo de 18 a été étudiée dans un modèle de xénogreffe de cellules HeLa. Les souris portant une tumeur ont été injectées par voie intrapéritonéale avec 18 (50 mg / kg) ou une solution de véhicule deux fois par jour pendant 28 jours. Les résultats expérimentaux in vivo ont montré que l’inhibition de BMK1 par 18 inhibait significativement la croissance tumorale de 95%, démontrant l’efficacité et la tolérabilité du traitement anticancéreux BMK1 chez les animaux (pour une étude d’efficacité in vivo plus complète, voir ref (22)) En conclusion, 11, 18 et 21 représentent un nouveau chémotype présentant des activités BMK1 puissantes et hautement sélectives. Ils ont été découverts en utilisant un profilage à l’échelle du kinome suivi d’une étude SAR guidée par BMK1 cellulaire. Étant donné leur excellente sélectivité pour les kinases, leurs paramètres pharmacocinétiques favorables et leur efficacité dans les modèles tumoraux de xénogreffes, la 2-amino-5,11-disubstituée-5H-benzo [e] pyrimido [5,4-b] [1,4] diazépine-6 (11H) -ones peuvent représenter un échafaudage privilégié pour le développement d’agents thérapeutiques ciblant BMK1.

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