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Profil moléculaire de la résistance aux médicaments dans la méningite tuberculeuse du sud-ouest de la Chine

La tuberculose est la forme la plus grave de tuberculose extrapulmonaire et entraîne une mortalité et une morbidité élevées. La résistance à l’isoniazide est fortement prédictive de la mort chez les patients avec TBMMéthodes Dans la présente étude, nous avons étudié la réaction en chaîne par polymérase PCR et le test de génotype MTBDRplus. Nos résultats ont montré que seulement un tiers des patients avec TBM avait un résultat positif pour la culture de Mycobacterium tuberculosis à partir du liquide céphalorachidien CSF La détection PCR de l’ADN de M tuberculosis dans le LCR n’est pas seulement un diagnostic alternatif approche pour TBM mais peut également être utilisé pour la détection de résistance aux médicaments lorsqu’il est combiné avec le test MTBDRplus, dont les résultats étaient compatibles avec le test de sensibilité aux médicaments classique Cependant, il a également permis le profil moléculaire des mutations beaucoup plus rapide que le test de sensibilité aux médicaments classique peut jour vs Dans les échantillons de CSF étudiés chez des patients avec TMB, nous avons trouvé un taux de résistance à l’isoniazide de%, de résistance à la rifampicine et de tuberculose multirésistante, ce qui est relativement plus élevé que la résistance rapportée dans la tuberculose pulmonaire. le profil moléculaire a indiqué que les mutations les plus fréquemment observées dans les gènes rpoB et katG sont également responsables de la pharmacorésistance dans les TBMConclusions. Nos données suggèrent que le test de ligne-sonde MTBDRplus est capable de détecter la résistance aux médicaments pour les échantillons de LCR. Nous recommandons le diagnostic basé sur la PCR et le test de résistance aux médicaments en tant que tests de routine pour les patients suspectés de TBM

La tuberculose tuberculeuse est la forme la plus grave de tuberculose extra-pulmonaire EPTB et provoque une mortalité et une morbidité exceptionnellement élevées , même lorsque l’organisme pathogène, Mycobacterium tuberculosis MTB, est sensible aux agents antituberculeux de première ligne Il a été démontré que presque tous les patients infectés par des isolats multirésistants, qui sont résistants aux médicaments antituberculeux de première intention les plus puissants, la rifampicine et l’isoniazide, sont susceptibles de mourir dans les mois suivant le diagnostic Identification rapide des souches de MTB pharmacorésistantes du liquide céphalo-rachidien La prévalence globale de la tuberculose pharmacorésistante a augmenté, la tuberculose multirésistante a été identifiée chez les patients atteints de tuberculose pulmonaire PTB ainsi que EPTB Bien que le phénotype et le génotype de la pharmacorésistance dans la PTB a été bien documenté, le statut de la drogue Dans les pays développés, des tests commerciaux de sensibilité aux médicaments moléculaires ont récemment été introduits pour la détection rapide de PTB multirésistante et ont grandement contribué à la diminution de la prévalence de PTB lorsqu’ils sont combinés. avec de bons programmes de traitement Cependant, dans les pays en développement comme la Chine, ces approches n’ont pas été adoptées en routine. La Chine est classée deuxième parmi les pays à forte charge qui représentent ensemble% des cas de tuberculose et ~% de tuberculose multirésistante La plupart des laboratoires de microbiologie clinique en Chine ne disposent pas d’un programme d’identification rapide et d’un programme de sensibilité aux médicaments pour le MTB. Notre hôpital de l’Université de Sichuan, Chengdu, Sichuan, en Chine, a été équipé d’une plate-forme Intégrer un diagnostic complet de la tuberculose et la détection rapide de la tuberculose pharmacorésistante avec curre Dans la présente étude, des échantillons de liquide céphalo-rachidien ont été prélevés sur des patients suspectés de TBM cliniquement suspectés et soumis à une PCR en temps réel par PCR pour l’ADN MTB à l’aide d’un kit commercial Qiagen, Hilden, Allemagne. dans les critères de diagnostic pour la TBM séquentiellement, ces échantillons de LCR positifs à la PCR pour l’ADN MTB ont été testés pour la résistance aux médicaments avec le test de ligne-sonde Genotype MTBDRplus Hain Lifescience, Nehren, Allemagne, basé sur la technologie DNA-Strip. permet l’identification génétique moléculaire du complexe MTB et sa résistance à la rifampicine et / ou à l’isoniazide. La performance des tests MTBDRplus a été validée de façon adéquate dans des tests directs sur des échantillons de spoutem à frottis positif et des isolats MTB dans diverses conditions de faible incidence, démontrant une excellente spécificité. bonne concordance avec les résultats phénotypiques DST [,,] Dans, ce kit commercial a été approuvé par l’Organisation mondiale de la Santé Dans ce kit, la résistance à la rifampicine est identifiée par des mutations dans le gène rpoB codant pour la sous-unité β de l’ARN polymérase. La résistance à l’isoniazide est identifiée pour le dépistage rapide de la résistance à la rifampicine et / ou isoniazide dans la tuberculose multirésistante à haut risque. par des mutations dans le gène katG codant pour la catalase-peroxydase et la région promotrice du gène inhA codant pour le nicotinamide adénine dinucléotide, réduit enoyl-acyl carrier protein reductase Dans la présente étude, nous avons déterminé pour la première fois les profils moléculaires de la rifampicine et de l’isoniazide résistance chez les patients avec TBM vivant dans le sud-ouest de la Chine

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

D’octobre à décembre, un total de cas suspects ont été diagnostiqués au TBM West China Hospital de l’Université du Sichuan et les cas ont été diagnostiqués sur la base de résultats positifs de culture MTB et / ou PCR pour des échantillons d’ADN caractéristiques et résultats radiologiques tomodensitométrie [TDM] et imagerie par résonance magnétique [IRM] Cette étude a été approuvée par le comité éthique du West China Hospital, Université du Sichuan, et des formulaires de consentement signés ont été obtenus auprès des patients inclus dans cette étude par ponction lombaire, ~ ML de CSF a été recueilli dans une bouteille stérile et soumis à des examens: mL a été utilisé pour l’analyse cellulaire et biochimique, mL pour la culture MTB et des tests traditionnels de résistance aux médicaments avec le système Bactec MGIT Becton Dickinson, Cockeysville, MD, et mL pour l’extraction de ADN MTB, qui a été utilisé pour PCR et MTBDRplus dosage pour déterminer le profil moléculaire de la résistance aux médicaments La quantité de CSF pour ces tests w tel qu’adopté d’une étude précédente ou les instructions du fabricant L’analyse cellulaire et biochimique a été réalisée avec une routine d’analyse de laboratoire CSF Modular P; Roche Diagnostics, Bâle, Suisse L’isolement du MTB a été réalisé à l’aide du système de culture liquide Bactec MGIT L’ADN du MTB a été extrait avec NucliSens EasyMag BioMérieux, Lyon, France Le DST standard a été réalisé avec le Bactec MGIT pour isoniazide et μg / mL. Le profil de génotype de la pharmacorésistance a été examiné à l’aide du test MTBDRplus. La présence d’anticorps anti-VIH du virus de l’immunodéficience humaine dans des échantillons sériques a été examinée à l’aide de l’analyseur immunologique automatisé Modular Analytics E HIV Combi; Roche Diagnostics Des mutations dans les gènes rpoB, katG et inhA associés à la résistance à la rifampicine et à l’isoniazide ont été identifiées en utilisant des kits MTBDRplus selon les instructions du fabricant. En bref, PCR μL / tube; Les produits de PCR Qiagen ont été analysés en% gel d’agarose coloré au bromure d’éthidium. Après hybridation, des bandes de membrane ont été attachées à la feuille d’évaluation, lues et interprétées par un opérateur qui a été aveuglé par les résultats bactériologiques et vice versa, selon les recommandations du fabricant. Les critères de stade du British Medical Research Council ont été utilisés pour évaluer la sévérité du TBM: stade I, score du GCS de Glasgow Coma Scale sans signes neurologiques focaux; stade II, signes d’irritation méningée avec léger ou pas d’opacification du sensorium et déficit neurologique mineur ou non neurologique crânien; GCS, -; stade III, trouble grave du sensorium, convulsions, déficit neurologique focal et mouvements involontaires GCS, & lt; Le Glasgow Outcome Scale GOS a été assigné rétrospectivement pour noter le résultat du suivi: décès; , état végétatif persistant; , incapacité grave dépendante pour le soutien quotidien; , handicap modéré handicapé mais indépendant; et, bonne récupération vie normale avec ou sans déficit neurologique et / ou psychologique mineur Généralement, un score GOS de – a été considéré comme un résultat médiocre et un score ou un bon résultat Les variables continues ont été décrites avec des médianes et des plages; les variables catégorielles ont été décrites avec des nombres et des pourcentages. Les analyses statistiques ont été effectuées avec la version du logiciel SPSS; SPSS La différence entre les groupes a été examinée à l’aide du test exact de Fisher. Les différences ont été considérées comme significatives pour P & lt;

RÉSULTATS

Tous les patients TBM qui ont été inclus dans cette étude ont montré des résultats positifs pour l’amplification PCR de l’ADN MTB, et ont également montré des résultats positifs pour la culture. Disséquer la valeur du test actuel de résistance aux médicaments dans le diagnostic de TBM en culture et PCR. Nous avons analysé et présenté les données pour ces patients dans des groupes distincts: patients positifs pour la culture et patients positifs pour la PCR Le profil démographique, les caractéristiques cliniques et les pronostics des patients sont résumés dans le tableau Les résultats de l’analyse du LCR sont résumés dans le tableau les signes positifs ne différaient pas significativement entre les groupes de patients, les patients positifs à la PCR semblaient montrer une plus grande sévérité de la maladie et des résultats plus médiocres que les patients positifs à la culture P & lt; Tableau Concernant les résultats de l’analyse du LCR, les compositions cellulaires et biochimiques des deux groupes soutiennent le diagnostic de TBM Cependant, il n’y avait pas de différence significative entre les patients positifs à la culture et positifs à la PCR ou entre les patients de novo et les patients précédemment traités. pour tous les paramètres Ces données suggèrent que la détection par PCR de l’ADN MTB dans le LCR est une approche alternative plus sensible pour le diagnostic de la TBM

Tableau Profil démographique, caractéristiques cliniques et pronostic des patients atteints de méningite tuberculeuse qui ont été testés positifs par culture de liquide céphalorachidien et / ou caractéristiques de réaction en chaîne de la polymérase Non% de patients positifs pour la culture n = Non% de patients PCR positifs n = P nombre total de patients N = âge médian, années comprises – – … – Sexe masculin Antécédents de tuberculose Caractéristiques cliniques à l’admission Maux de tête Fièvre Vomissements Altération mentale Déficit focal Saisies & gt; Signes méningés Conscience altérée Coma & gt; Paralysie du nerf crânien Hémiparésie et / ou paraparésie Anomalies de la CMRC de grade I & lt; a II a III Anomalies de l’IRM et de la tomodensitométrie Hydrocéphalie & gt; Amélioration de la méningite Infarctus Tuberculome & gt; Tuberculose extrameningeal & gt; Pronostic Dead & gt; Etat végétatif persistant Handicap sévère Handicap modéré & gt; Bon rétablissement a Caractéristiques Non% de patients positifs à la culture n = Non% de patients PCR positifs n = P Non% du total des patients N = Âge médian, années – – … – Sexe masculin Antécédents de tuberculose Aspects cliniques à l’admission Maux de tête Fièvre Vomissements Altération mentale Déficit focal Saisies & gt; Signes méningés Conscience altérée Coma & gt; Paralysie du nerf crânien Hémiparésie et / ou paraparésie Anomalies de la CMRC de grade I & lt; a II a III Anomalies de l’IRM et de la tomodensitométrie Hydrocéphalie & gt; Amélioration de la méningite Infarctus Tuberculome & gt; Tuberculose extrameningeal & gt; Pronostic Dead & gt; Etat végétatif persistant Handicap sévère Handicap modéré & gt; Bon rétablissement a Abréviations: BMRC, British Medical Research Council; CT, tomodensitométrie; IRM, imagerie par résonance magnétique; PCR, polymerase chain reactionaP & lt; Voir grand

Résultats de l’analyse du liquide céphalo-rachidien chez les patients atteints de méningite tuberculeuse testés positifs par culture CSF et réaction en chaîne de la polymérase Analyse du liquide céphalorachidien Intervalle médian des patients positifs pour la culture n = Gamme médiane de patients PCR positifs n = Gamme médiane de tuberculose de novo n = Intervalle médian des patients précédemment traités n = Intervalle médian des patients totauxN = Pression d’ouverture, cm HO – – – – – Nombre total de leucocytes, cellules / L – – – – – Nombre de lymphocytes,% – – – – – Niveau de glucose, mmol / L – – – – – Ratio du LCR au glucose dans le sang – – – – – Niveau de protéines, mg / dL – – – – – Niveau de chlore, mmol / L – – – – – Résultats GTplus valides, non% des patients Analyse Gamme médiane de patients positifs pour la culture n = Gamme médiane de patients positifs pour la PCR n = Gamme médiane de patients atteints de tubercules de novo la fourchette n = Gamme médiane de patients déjà traités n = Gamme médiane des patients totauxN = Pression d’ouverture, cm HO – – – – – Nombre total de leucocytes, cellules / L – – – – – Nombre de lymphocytes,% – – – – – Niveau de glucose , mmol / L – – – – – Ratio du LCR au glucose dans le sang – – – – – Niveau de protéines, mg / dL – – – – Taux de chlore, mmol / L – – – – – Résultats GTplus valides, non% des patients Abréviations: GTplus, test de ligne-sonde de génotype MTBDRplus; PCR, amplification en chaîne par polyméraseView LargeLa majorité des patients avec TBM présentaient des caractéristiques cliniques typiques telles que la fièvre, les maux de tête, les signes méningés et les changements du LCR tels que leucocytose, élévation des taux protéiques et taux de glucose plasmatique inférieur à Les anomalies d’imagerie les plus fréquemment observées en IRM et tomodensitométrie ont été observées. Les bacilles acidorésistants n’ont été observés sur aucun frottis de LCR et aucun patient n’a été séropositif pour le VIH. Patients Une tuberculose extraméningéienne concomitante a été observée chez% des patients: atteinte pulmonaire et atteinte de la colonne vertébrale.Des isolats de MTB récupérés à partir d’échantillons de LCR ont été examinés en utilisant la DST standard créatinine. Cinq% des souches étaient sensibles et les autres étaient résistantes à l’isoniazide. souches souches multi-résistantes et souches monorésistantes à l’isoniazide En outre, le MTBDRplu Les résultats interprétables sans ambiguïté dans le profil d’hybridation ont été obtenus dans des échantillons provenant de% de patients. Un résultat illisible a été défini comme étant soit aucune bande du tout, soit des bandes très faibles ou illisibles dans rpoB, katG et / ou des sections inhA; ceci a été observé dans les cas positifs pour la PCR Chez les patients positifs pour la culture, les résultats du test MTBDRplus étaient en accord avec les résultats standard de la DST Tableau Dans le groupe PCR-positif, un taux de résistance aux médicaments de% des patients a été observé. Les profils pharmacorésistants de la rifampicine et de l’isoniazide sont résumés dans le tableau En outre, pour déterminer si la pharmacorésistance était liée à un traitement antérieur, nous avons divisé les patients en novo et en les traitant précédemment. Nous avons constaté que, bien que le profil de monorésistance à la rifampicine ou à l’isoniazide n’ait pas montré de signification, le taux de multirésistance était plus élevé dans le groupe précédemment traité que dans le groupe de novo, ce qui étaye l’hypothèse selon laquelle aux antituberculeux peuvent augmenter le risque de multirésistance chez les patients atteints de TBM Quant à la fréquence de la pharmacorésistance e, il semble que la résistance à l’isoniazide est plus fréquente que celle à la rifampicine dans tous les groupes de patients avec TBM

Tableaux de résistance aux médicaments dans les résultats valides du test de ligne-sonde du génotype MTBDRplus Modèle de résistance aux médicaments Nombre de patients positifs pour la culture n = Nombre de patients PCR-positifs n = P Nombre de patients atteints de tuberculose de novo = Nombre de patients précédemment traitésn = P Nbre de patients totaux N = Résistance à tout médicament, aucun% des patients Résistance multidrogue & gt; une monorésistance à la rifampicine & gt; Monorésistance à l’isoniazide Résistance à la rifampicine, aucun% de patients Résistance à l’isoniazide, b pas% de patients Élevé & gt; Faible & gt; Nombre de patients positifs pour la culture n = Nombre de patients PCR positifs n = P Nombre de patients atteints de tuberculose de novo = Nombre de patients précédemment traités n = P Nombre total de patients N = Résistance à tout médicament, non% de patients Multidrogue résistance & gt; une monorésistance à la rifampicine & gt; Monorésistance à l’isoniazide Résistance à la rifampicine, aucun% de patients Résistance à l’isoniazide, b pas% de patients Élevé & gt; Faible & gt; aP & lt; bLa résistance à haut et bas niveau est définie comme une résistance à l’isoniazide avec une concentration de et μg / mL dans le milieu de culture, correspondant aux mutations du gène katG et inhA, respectivement.Vérifier que% des isolats sont des résultats génotypiques du test MTBDRplus. Parmi ces mutations, celles des codons rpoB – représentaient% de la résistance à la rifampicine et celles de katG représentaient% de la résistance à l’isoniazide. Une tendance similaire a été observée chez En résumé, un taux élevé de résistance aux médicaments a été observé dans les souches de TBM Le profil de résistance aux médicaments et le profil moléculaire des mutations sont illustrés dans la figure. Pour les détails des mutations pour le modèle d’hybridation, veuillez consulter le tableau supplémentaire En ligne seulement

Tableau Résultats Génotypiques du Génotype MTBDRplus Line-Probe Assay pour la Détection de la Résistance à la Rifampicine et à l’Isoniazide, gène, codon Non% de cas avec une résistance aux médicaments n = Non% des cas de multirésistance n = Rifampicine, pas de cas rpoB, – rpoB, Isoniazide, un nombre de cas katG, inhA, médicament, gène, codon Non% de cas avec une résistance aux médicaments n = Non% des cas avec une multirésistance n = Rifampicine, pas de cas rpoB, – rpoB, Isoniazide, un non de cas katG, inhA, un cas a montré des mutations à la fois dans katG et inhAView Large

Figure Vue grandDownload slidePhenotype et génotype de la résistance aux médicaments chez les isolats de Mycobacterium tuberculosis provenant de patients atteints de méningite tuberculeuse TBM Un total de souches pharmacorésistantes a été détecté dans des échantillons de liquide céphalo-rachidien provenant de patients atteints de TBM; la résistance est présentée comme le pourcentage d’isolats résistants A Des mutations dans les gènes kat et inhA ont été détectées parmi les souches résistantes à l’isoniazide INH; les fréquences des mutations sont montrées B Des mutations dans rpoB – et rpoB ont été détectées parmi les souches résistantes à la rifampicine RIF; les fréquences des mutations dans le gène rpoB sont montrées C MDR, multirésistanteFigure View largeTélécharger slidePhenotype et génotype de résistance aux médicaments chez les isolats de Mycobacterium tuberculosis chez les patients atteints de méningite tuberculeuse TBM Un total de souches pharmacorésistantes a été détecté dans des échantillons de liquide céphalo-rachidien TBM; la résistance est présentée comme le pourcentage d’isolats résistants A Des mutations dans les gènes kat et inhA ont été détectées parmi les souches résistantes à l’isoniazide INH; les fréquences des mutations sont montrées B Des mutations dans rpoB – et rpoB ont été détectées parmi les souches résistantes à la rifampicine RIF; les fréquences des mutations dans le gène rpoB sont montrées C MDR, multirésistante

DISCUSSION

Mutations B dans les codons – et% dans le codon, et% de mutations de katG et% of inhA. La mutation SL dans le gène rpoB et la mutation ST dans le gène katG étaient les mutations les plus fréquemment observées parmi les souches multi-résistantes et monorésistantes. Cependant, un pourcentage anormalement élevé de souches monorésistantes à l’isoniazide ont été observés avec une hybridation positive à double motif avec des sondes mutantes et de type sauvage chez des mutants katG, qui avaient été rapportés dans des études antérieures. études d’échantillons d’expectoration [,,] Selon les instructions du fabricant, ces résultats indiquent la présence de souches hétérogènes ou de populations mixtes de MTB et ont toutes été interprétées comme une résistance au médicament concerné. La transmission de souches mixtes avec ces mutations dans PTB peut être un mécanisme sous-jacent au taux élevé de ces souches pharmacorésistantes dans les cas de tuberculose , dans le TBM, la possibilité d’une surinfection avec une deuxième souche est peu probable Une étude récente a démontré qu’une souche résistante à l’isoniazide avec la mutation katG pourrait être plus susceptible de développer la capacité multirésistante Par conséquent, nous spéculons que les souches MTB avec des motifs doubles représentent des souches de type sauvage dans l’infection initiale, dont certains ont acquis ces mutations dans le développement de TBM Parce que nous ne disposons pas de données sur la résistance aux médicaments dans le site d’infection primaire des poumons, nous ne savons pas si le Nous avons obtenu quelques informations importantes concernant le diagnostic du TBM et la résistance aux médicaments. Premièrement, seulement un tiers des patients avec TBM ont montré un résultat positif pour la culture MTB, ce qui suggère qu’une culture négative du CSF n’est pas positive. un critère pour exclure le TBM Deuxièmement, non seulement les résultats positifs à la PCR étaient compatibles avec tous les résultats positifs pour la culture, mais la PCR a également détecté Les résultats du test de résistance aux médicaments moléculaires étaient en accord avec ceux de la méthode standard DST standard, mais la résistance aux médicaments moléculaires le dosage est beaucoup plus rapide que le jour, ce qui est critique et particulièrement précieux pour les patients atteints de TBM comme guide pour une thérapie opportune et adéquate. Enfin, c’est le premier rapport sur la pharmacorésistance chez les patients TBM vivant dans le sud-ouest de la Chine. En plus des résultats ci-dessus, nous avons également observé que les patients positifs à la PCR avec TBM qui n’avaient pas de cultures positives de CSF avaient une plus grande sévérité de la maladie et Tableau de pronostic plus sombre, bien que ces patients aient reçu un traitement similaire: lévofloxacine ou amikacine en plus du schéma classique d’isoniazide , rifampicine, éthambutol et pyrazinamide Une raison possible est une fréquence relativement élevée de la monorésistance initiale à l’isoniazide. L’isoniazide est la pierre angulaire de la chimiothérapie moderne de courte durée contre la tuberculose; il est unique parmi les agents antituberculeux de première ligne pour ses propriétés doubles de haute pénétration du LCR et activité bactéricide précoce, ce qui en fait un médicament essentiel pour le traitement réussi de la TBM CDC a rapporté que la résistance à l’isoniazide est fortement prédictive de décès chez les patients Par conséquent, la résistance à l’isoniazide pourrait contribuer considérablement à la mortalité globale et à la morbidité associée de la TBM. Nous exhortons donc tous les professionnels de la santé dans les zones à forte tuberculose à prendre conscience de la tuberculose pharmacorésistante chez les patients suspectés de TBM. D’abord, notre constatation pourrait ne pas être applicable à la population générale. Deuxièmement, le test basé sur la sonde PCR n’est pas disponible actuellement pour les autres antituberculeux. Troisièmement, comme cette étude incluait seulement les patients, certaines différences significatives entre les groupes ont été détectés lors de l’analyse statistique Accumulation de plus phénotypique et ge Des données notypiques sur la pharmacorésistance chez les patients atteints de TBM de différentes régions sont nécessaires pour bien comprendre l’ensemble des schémas de pharmacorésistance en Chine, ce qui sera utile pour élaborer de nouvelles politiques d’administration de la santé publique et de nouvelles thérapies pour les patients TBM. Nos données suggèrent que le test de ligne-sonde Genotype MTBDRplus est capable de détecter la résistance aux médicaments dans les échantillons de LCR qui ont une PCR. résultat positif Nous recommandons aux médecins de commander un test d’amplification de l’acide nucléique sur les échantillons de liquide céphalo-rachidien de tous les patients ayant un TBM suspecté. Si un résultat positif est obtenu, un test de DST moléculaire doit être immédiatement demandé

Remarques

Remerciements

Nous remercions Haiyan Chen Rush Université Medical Center, Chicago, IL et James Walter Hines VA Hôpital, Hines, IL pour l’examen critique et l’assistance éditoriale lors de la préparation du manuscrit

Aide financière

Ce travail a été soutenu par la subvention de la National Science Foundation of China; le programme clinique clé de la subvention du ministère de la Santé; et les projets dans le département des sciences et de la technologie du programme de pilier de la province du Sichuan subvention SZ

Conflits d’intérêts potentiels

Tous les auteurs: Aucun conflit rapporté Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués

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