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Aurones à 2-hydroxypyridine-N-oxyde comme inhibiteurs puissants de la tyrosinase humaine

Tyrosinases (Ty, EC 1.14.18.1)

sont des métalloenzymes contenant du cuivre de type 3 réparties sur une large gamme

des organismes, en particulier les mammifères, les champignons, les bactéries et les plantes.1 Ils comprennent un site actif binucléaire, composé

par deux centres de cuivre proches (dCu – Cu ≈ 2.9 à 4.9 Å) ponté par un ligand aquo (hydroxo) dans

un état rencontré, coordonné par six résidus histidine. Ty catalyse le

oxydation des phénols et des catéchols en catéchols et en ortho-quinones, respectivement (schéma 1). Chez les mammifères, les transformations

des substrats naturels Ty, de la L-tyrosine et de la L-DOPA,

dans les quinones réactives sont les premières étapes de la mélanogenèse.3 Les pigments de mélanine résultants jouent un rôle protecteur

rôle contre le rayonnement UV et les radicaux libres. Malgré dicopper similaire

sites actifs (voir l’information à l’appui) et une fonction commune, c.-à-d., l’oxydation du phénol / catéchol,

différences ont été soulignées au niveau cellulaire et structurelle parmi

les Tys provenant de sources distinctes, notamment végétales (TyP), champignons (TyM),

bactérienne (TyB), et humaine (TyH) .4 En effet,

tandis que TyM et TyB sont généralement des enzymes oligomères solubles présentes

dans le cytosol, TyH existe sous la forme d’un mélanosome monomère hautement glycosylé

protéines transmembranaires.5,6 De même, de fortes divergences

sont observés lors de la comparaison de séquence, une divergence qui a été

corroboré à un niveau structurel au cours de la dernière décennie par la résolution

de structures cristallographiques de deux TyB (de Bacillus megaterium, TyB17 et Streptomyces castaneoglobisporus, TyB2), 8 TyM (d’Agaricus)

bisporus, TyM19,10 et TyM2,11,12 et Aspergillus oryzae, TyM3), 13 et très récemment un TyP (de Juglans regia) 14 et une polyphénol oxydase présentant

activité tyrosinase vers certains substrats (de Coreopsis

grandiflora) .15,16 Plus précisément, l’identité globale

est faible (10 – 30%) entre TyMs, TyBs et TyH. Autour de l’actif

site (58% d’identité dans 6 Å à partir du centre de métal dans TyM1 et

TyB2), les environnements sont similaires (voir Informations de support), malgré certaines fonctionnalités clés non partagées entre tous

Tys (par exemple, un ligand d’histidine CuA conservé réticulé

à un résidu de cystéine dans TyMs et TyP, une modification post-traductionnelle

absent des TyB et TyH) .17 Bien que préliminaire

des études cristallographiques sur TyH ont été rapportées très récemment,

aucune structure n’est disponible à ce jour à une résolution atomique.18 Cependant, un modèle d’homologie robuste construit en utilisant

données structurelles de TyB2 et Ipomea batatas catechol

oxydase a été récemment publié.19Schéma 1Inhibition et voies de catalyse: Interactions putatives entre

Dérivés HOPNO et la forme Met des humains TyIn, les troubles liés à la mélanine sont connus pour provoquer une hyperpigmentation cutanée, 20 lésions cutanées, 21 ou

mélanome

résistance aux traitements conventionnels.22 Comme l’inhibition de Ty est une stratégie bien établie pour contrôler

production de mélanine in vivo, comme démontré à nouveau

récemment, 23 le développement d’inhibiteurs de TyH

suscite un intérêt considérable pour la dermocosmétique24 et les thérapies contre le cancer25.

Alors que les faibles homologies entre les différentes formes de Ty excluent

toute extrapolation des études d’inhibition effectuées sur TyM à TyH, un

littérature abondante est dédiée aux inhibiteurs de TyM pour les applications humaines26. En conséquence, seulement une poignée d’entre eux sont en fait

utilisés en tant qu’agents de dépigmentation, tels que l’hydroquinone, l’arbutine ou

acide kojique (KA) .27 Malheureusement, actuellement

les inhibiteurs utilisés n’ont pas l’affinité et la sélectivité requises pour le ciblage TyH

Des applications et une toxicité dangereuse ont souvent été signalées.4,28 Par conséquent, il existe un besoin urgent de nouveaux inhibiteurs sélectifs de la TyH.

qui correspondent aux normes d’efficacité et de sécurité requises pour le développement

des produits destinés à l’usage humain. Au cours des dernières années, nous avons signalé

que les aurones (2-benzylidènebenzofuran-3 (2H) -ones),

flavonoïdes naturels, 29,30 agissent comme inhibiteurs de

la biosynthèse de mélanine dans les mélanocytes humains, 31 comme effecteurs de TyM, 32,33 et comme sondes moléculaires pour la

investigation du site de liaison

l’homologie structurelle entre TyM et TyB.17 Dans l’une de ces études précédentes, 32

suggéré que ces composés se lient au site actif Ty avec leur

B-anneau, dont les substituants ont déterminé le comportement de divers aurones

vers les deux enzymes (c’est-à-dire, inhibiteur, activateur ou substrat). Inversement,

le profil d’hydroxylation du cycle A des aurones a affecté l’activité

gamme et sélectivité pour TyM1 ou TyB3 (TyB de Streptomyces

antibioticus, qui appartient au même genre Streptomyces et partage 82% d’identité avec TyB2), parfois considérablement

(Aurones V sur la figure ​ Figure 11). En parallèle, nous avons découvert et étudié

analogue de transition HOPNO, un catechol-imitant, non-oxydable

fragment (Schéma 1),

en tant qu’inhibiteur puissant de TyM1 (Kic = 1,8

μ M) .34 Enrobage de cette petite partie

dans un squelette d’aurone généré “ hybrid ” aurone 1a, qui a montré une activité d’inhibition de TyM1 dans la même gamme

comme HOPNO (Figure ​ Figure 11) .32Figure 1Les structures générales des aurones précédemment identifiées comme

effecteurs

de TyM1 et TyB3. Ces composés étaient des substrats (anneau B en bleu),

activateurs (B-anneau en vert), ou inhibiteurs (B-anneau en orange) de

TyM1. Pour les inhibiteurs, les valeurs IC50 correspondantes contre

TyM1 … Nous rapportons ici la synthèse de trois aurones hybrides, dont

Un anneau

modèles de substitution ont été sélectionnés de manière réminiscente de notre précédente

résultats sur les mélanocytes humains, 31 ainsi que

leur évaluation biologique par des tests in vitro

en utilisant (1) du TyH recombinant purifié (provenant d’Homo sapiens) et (2) des cellules de mélanome MNT-1 humain. Les interactions du plus

Aurone hybride active avec TyH ont ensuite été rationalisés en combinant

Dynamique QM / MM et analyse d’interaction non covalente (NCI), en utilisant

modèle d’homologie récente de TyH mentionné ci-dessus.19 Des comparaisons ont été faites avec les interactions de la fraction HOPNO

seul sur TyH. ​​Dans l’ensemble, nos études récentes ont mis en évidence un remarquable

versatilité

d’aurones en tant qu’agents Ty-interacting, ce qui nous permet de recueillir précieux

informations sur la relation entre leur schéma de substitution et

leurs activités.17,31,32 Le B-anneau d’aurones, car il interagit directement avec le actif

site, complètement déterminé leur comportement général envers TyM1 et

TyB3. En effet, les aurones I et II agissent comme alternative

substrats, aurones III et IV comme activateurs

(pour TyM1) ou des inhibiteurs faibles (pour TyB3), et aurones V en tant qu’inhibiteurs mixtes (Figure ​ Figure 11). Nous avons également démontré l’influence des mal conservés

deuxième et troisième sphères de coordination du site actif dicopper

comme de fortes caractéristiques discriminantes. En effet, les différences en termes

d’activité parmi des aurones substituées par un anneau A pour un seul

Le type Ty atteint jusqu’à 100 fois. La même plage de variabilité était

observé lors de la mesure de l’activité d’une aurone donnée contre Tys

En outre, une amélioration significative

a été fourni par le HOPNO

fragment en termes d’activité d’inhibition de TyM1 (par exemple IC50 = 1,5 μ M pour 1a par rapport à > 1000 μ M pour

la

analogue 6-hydroxyaurone V) .17,32 Pour soutenir davantage le potentiel de ce groupe, nous avons défini l’ionisation

état impliqué dans la liaison. Les valeurs constantes de protonation pour 1a – c ont ainsi été déterminées par spectrophotométrie

titrages dans l’eau / DMSO (90/10, p / p, voir Information complémentaire). Constantes de protonation correspondant au HOPNO

fragment (log KN – OH, intervalle 5.4 – 5.8)

incrusté sur les aurones indiquent qu’à pH physiologique, le fragment HOPNO

en 1a – c existe exclusivement dans un

forme anionique, facilitant ainsi la fixation sur le centre dicopper

(Tableau 1). Ces valeurs

sont inférieurs à ceux de HOPNO libre (6.07), 35 et inférieurs aux constantes de protonation pour les groupes hydroxyles à

position 4 ′ d’aurones I (R4 = H ou

OH, R6 = OH) et II (R4 = R6 = OH), dans la gamme 8,336 (corroborée par les valeurs classiques trouvées pour les groupes -hydroxy).

de flavonoïdes dans la littérature), 37,38 indiquant

que ces fragments sont entièrement protonés à un pH physiologique. Celles-ci

les données ont renforcé le potentiel de la contribution de HOPNO par rapport aux dérivés phénoliques,

pour interagir avec les ions de cuivre.Tableau 1Protonation

Constantes, inhibition

Constantes (Ki) sur TyH purifié, IC50 sur cellules de mélanome humain MNT-1 et valeurs de cytotoxicité (IC50) sur les cellules MNT-1 pour les composés 1a – cAll ces éléments ont fourni les

raison d’être pour concevoir et produire

les aurones HOPNO-embedded. La synthèse des aurones 1a a été réalisée selon le Schéma 2 à partir des dérivés de benzofuran-3 (2H) -one 2a – 2c (voir Informations de support) .39 Nous avons ensuite étudié comparativement les aurones hybrides.

et HOPNO sur TyH isolé. Pour cette étude, nous avons utilisé un recombinant

TyH produit dans des cellules d’insectes qui a été très récemment validée par

l’évaluation d’un certain nombre de substrats et d’inhibiteurs connus.4 Pour cette enzyme, nous avons déjà déterminé

les paramètres cinétiques de Michaelis – Menten pour l-DOPA

oxydation, obtenant une valeur Km de 0,34

± 0,03 mM et une valeur kcat de 38,1

± 0,7 s – 1.4 Le

effet des aurones 1a – c sur l’oxydation

de l-DOPA par TyH a été étudiée. Premièrement, nous avons vérifié si

L’inhibition de TyH était dépendante de la concentration. Le comportement cinétique de

TyH pendant l’oxydation de l-DOPA a ensuite été étudiée

générer des courbes de vitesses de substrat en présence de divers

concentrations d’inhibiteurs. L’analyse des courbes d’inhibition

indique un mode d’inhibition compétitif, compatible avec une

lien vers le site actif. Les constantes d’inhibition ont ensuite été déterminées

par régression non linéaire et ajustement de la courbe (voir Information de support) .Schéma 2Synthèse des Aurones Hybrides 1Compounds 1b et 1c partagés similaires

puissance d’inhibition (Kic = 1,02 et 1,2

μ M, respectivement, Tableau 1), tandis que l’analogue 1a a été trouvé 3,5 fois plus

actif. Cela indique peut-être un effet préjudiciable de la présence

d’un groupe hydroxyle en position 4 des aurones. Fait intéressant, l’évaluation

de la fraction HOPNO dans les mêmes conditions fournies très différents

résultats. En effet, en considérant l’inhibition de TyH, HOPNO a été trouvé

inhibiteur très faible, avec un Ki de 128

μ M, environ 350 fois plus élevé que la valeur mesurée pour

composé 1a, alors qu’il était précédemment trouvé plutôt

inhibiteur puissant de TyM134 et TyB340 (Ki = 1,8 et 7,7

μ M, respectivement). Ces données soulignent le rôle crucial de

tout le squelette aurone, et pas seulement le fragment HOPNO intégré,

dans les activités rapportées ici. De plus, une corrélation pourrait être

observé entre les valeurs de pKN – OH

et les valeurs Ki contre TyH, l’inhibition

la puissance des composés testés (y compris HOPNO) renforçant la déprotonation

de la partie N – OH augmente.Pour comprendre

la réactivité des aurones avec TyH et plus

précisément le rôle de l’épine dorsale aurone, des études théoriques ont été

mené. Nous avons concentré notre attention sur l’hybrone aurone 1a la plus active et des comparaisons ont été faites avec les interactions de la

Fragment HOPNO sur TyH. La dynamique QM / MM suivie d’une analyse NCI était

effectué. Pour la position initiale, nous avons fait l’hypothèse que 1a et HOPNO adopteraient le mode de liaison monodentate (schéma 1) obtenu dans notre

travail précédent sur TyB240 dans lequel l’oxygène

atome du groupe nitrosyle de HOPNO est fixé uniquement sur un atome de cuivre

(voir Informations de support).

La méthode NCI calcule un indice basé sur la densité électronique

et le gradient de densité électronique.41

index présente des singularités à faible densité lorsqu’une interaction faible

apparaît entre deux fragments. La force de ces interactions

peut également être calculé et isosurfaces peuvent être tracés pour visualiser

les domaines des interactions non covalentes. Ainsi, les surfaces bleues représentent

interactions fortes et attrayantes (comme les liaisons hydrogène), alors que la

les vertes indiquent les interactions faibles (comme les interactions de van der Waals). Figure ​ Figure22 montre une moyenne

positionner avec des surfaces NCI issues des complexes TyH & H0NO1313; HOPNO et TyH ߝ 1a extraits de leurs trajectoires dynamiques QM / MM.

Si HOPNO est apparu comme fermement lié à l’un des deux centres de cuivre

en mode monodenté, seules quelques interactions ont été observées

résidus environnants de la deuxième sphère de coordination. Au contraire,

le composé 1a a révélé un modèle d’interaction étendu

impliquant des résidus de points chauds relativement éloignés des cuivres, tels

comme Ile368, Arg308, Lys306 et His304, et permettant un ajustement robuste de 1a à l’intérieur de la poche du site actif. Ces observations sont en

bon accord avec les valeurs de Ki mesurées expérimentalement. Figure 2 Position moyenne de HOPNO – TyH (A)

et 1a – TyH

(B) complexes après dynamique QM / MM. Les surfaces NCI (en vert) représentent

interactions moléculaires et sont générés avec une densité d’électrons

valeur de gradient de 0,35 au (unités atomiques). Enfin, la capacité des aurones 1a – c à supprimer la biosynthèse de la mélanine dans un système cellulaire intégré humain

modèle (cellules MNT-1 de mélanome humain) a été évalué. Résultats de la cellule

les lysats ont confirmé la puissance des aurones hybrides pour prévenir la mélanogenèse

dans un environnement cytoplasmique complexe humain, avec un ordre d’inhibition

puissance similaire à celle obtenue à partir de l’inhibition de TyH isolée

dosage (tableau 1). Effectivement,

le composé 1a a atteint une CI50 inférieure (IC50 = 16,6 μ M), comparé au composé 1b et au composé 1c, qui ont obtenu des valeurs IC50 environ deux fois

plus élevé (IC50 = 30 et 34 μ M, respectivement). La contribution

de l’échafaud aurone est resté très important, comme HOPNO seul avait

une très faible activité sur les lysats (IC50 = 1300 μ M).

Les “ hybrides ” révélé une capacité limitée à entraver

mélanogenèse dans des cellules entières MNT-1. Les valeurs IC50 enregistrées

variait de 85,3 (pour 1a) à 120 μ M (pour 1b), avec une faible cytotoxicité concomitante des composés

à de telles concentrations, sauf pour 1b (tableau 1). Ces valeurs ont été trouvées

3,5 – 5 fois plus élevé que ceux des lysats. Ces résultats suggèrent

une faible capacité des composés hybrides 1a – c à traverser les membranes cellulaires MNT-1 qui peuvent provenir du

caractère zwitterionique partiel du groupe HOPNO, car ce fragment est

probablement un équilibre tautomère entre les formes N-hydroxy-2-pyridinone et 2-hydroxypyridine-N-oxyde. Néanmoins, les composés à base de HOPNO ont déjà démontré

très bonne capacité à agir dans des contextes cellulaires et physiologiques.42,43 Enfin, il convient de noter que, dans les conditions testées, la référence

KA a été trouvé presque complètement inactif à la fois sur le lysat et sur les cellules entières. En conclusion, une série d’aurones HOPNO-embedded ont été synthétisées

et évalué pour déterminer leur pouvoir d’inhibition contre TyH et

pour élucider la valeur ajoutée du squelette aurone par rapport à la

Fragment HOPNO seul. Si les aurones décrits sont d’excellents inhibiteurs

de TyH, un écart considérable existe en termes de puissance d’inhibition entre

ces composés et le fragment HOPNO, indiquant un avantage indéniable

effet du squelette aurone, confirmé par un calcul théorique.

Enfin, il est intéressant de noter que, à notre connaissance, le composé 1a est l’inhibiteur de TyH le plus actif jamais rapporté (Ki = 0,35 μ M). Son efficacité inférieure dans

suppression de la mélanogenèse dans les cellules entières humaines MNT-1 reste à être

adressé. Nous mettons ainsi en lumière le grand potentiel de ces composés

pour les applications dirigées par l’homme et comme outils pour déchiffrer la tyrosinase

rôle dans des pathologies telles que le mélanome.25

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