Menu

Maria Selma Restaurant

L’évolution de la forme du VIH chez les patients ayant subi un traitement antirétroviral avec un nombre de lymphocytes T CD prolongés mais une défaillance virologique persistante

Contexte Au cours des dernières années, les lignes directrices de traitement de l’infection par le VIH ont évolué de la monothérapie à des schémas thérapeutiques associant des médicaments actifs, entraînant une forte diminution de la morbidité et de la mortalité. l’introduction séquentielle de stratégies de traitement antirétroviral chez des patients chroniquement infectés avec une numération cellulaire CD soutenue malgré une charge virale persistante détectable. Méthodes Des échantillons plasmatiques ont été prélevés avant et pendant le traitement pour construire un virus recombinant contenant l’antigène-gag, la protéase et la reverse-transcriptase région codante Le phénotype de sensibilité au médicament a été évalué avec un panel de plusieurs inhibiteurs de la transcriptase inverse et de la protéase. La capacité de réplication RC et l’infectiosité ont été mesurées et la production de p a été surveillée après la transfection. les apy étaient moins en forme et infectieuses que leurs homologues de type sauvage ou monothérapeutique, à l’exception des virus récupérés sur le patient B. Dans les cas, la cinétique p après transfection a montré un retard de production virale de virus recombinants contenant des mutations MDR. et les tests d’infectivité ont montré une bonne corrélation P & lt; et corroborées les données de cinétique p Conclusions Cette étude montre que l’accumulation de mutations MDR au cours du traitement antirétroviral à long terme aboutit, quoique pas dans tous les cas, à des réductions de la capacité virale

Utilisation de schémas thérapeutiques combinés avec des inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse Les INTI, les inhibiteurs de la protéase, les inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse et les inhibiteurs de l’entrée ont contribué à la diminution de la mortalité. et la morbidité chez les patients infectés par le VIH Au cours du traitement, des variants VIH pharmacorésistants émergent souvent à la suite de régimes impuissants, d’une observance suboptimale, d’obstacles pharmacologiques ou de compartiments mal traités, ce qui constitue une Les goulots d’étranglement fréquents introduits par un nouveau traitement antirétroviral conduisent à des variations de la forme virale et de la distribution quasi-spécifique de la population virale. L’évolution de la pharmacorésistance est souvent caractérisée par des pertes de forme significatives, qui peuvent être partiellement compensées mutations ou autre canal adaptatif ges Cependant, l’impact global de la thérapie antirétrovirale actuelle est encore inconnu et controversé. Le fait que, pendant l’échec du traitement, la charge virale reste souvent partiellement inférieure aux niveaux de préthérapie, et le fait que les numérations cellulaires CD restent stables , semblent être liés à la sélection des variants du VIH présentant une capacité de réplication réduite Certaines études ont montré que les virus hautement résistants aux médicaments sont moins adaptés que les virus sauvages en l’absence de médicament À cet égard, la réplication virale Ainsi, les patients dont la capacité de réplication virale est plus faible ont des augmentations significativement plus importantes du nombre de cellules CD du nadir que les personnes infectées par des virus moins altérés. Le but de cette étude était d’étudier les changements de la forme virale associés à l’introduction séquentielle de classes de médicaments tirétroviraux chez les patients chroniquement infectés par le VIH, avec une infection caractérisée par une numération prolongée des cellules CD malgré la présence d’une charge virale détectable lors d’un traitement antirétroviral à long terme Nous avons ainsi généré des virus recombinants à partir d’échantillons plasmatiques obtenus avant ou peu après la monothérapie. , ainsi que quelques années plus tard au cours de HAART, et nous avons évalué les changements dans le profil de la capacité de réplication de ces virus

Méthodes

Patients et échantillons plasmatiques Nous avons étudié des échantillons prélevés rétrospectivement chez des patients VIH infectés de façon chronique. Figure A-D Des échantillons de plasma ont été prélevés et identifiés avec les derniers chiffres de l’année de collecte comme suffixe et tableau du patient. les diminutions n’ont jamais été & gt; cellules / μL au cours de la période d’étude, en dépit de l’échec virologique VIH-ARN niveau, & gt; copies / mL, après avoir reçu plusieurs traitements successifs sur plusieurs années Tableau Ces critères ont été remplis par% de patients dans notre base de données

Figure Vue largeTéléchargement Diapositives Représentations schématiques des patients A-D inclus dans l’étude Cercles remplis, numération cellulaire CD; cercles creux, charges virales plasmatiques; barres au-dessus des panneaux de la figure, durées des régimes avec différentes classes de médicaments; des flèches, des fois quand on a obtenu des échantillons Les échantillons de plasma sont identifiés par la lettre du patient et les derniers chiffres de l’année de collecte NNRTI, les inhibiteurs de la transcriptase inverse non nucléosidiques; Les INTI, les inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse; IP, inhibiteurs de la protéaseFigure View largeTélécharger Diapositives Représentations schématiques des patients A-D inclus dans l’étude Cercles remplis, numération cellulaire CD; cercles creux, charges virales plasmatiques; barres au-dessus des panneaux de la figure, durées des régimes avec différentes classes de médicaments; des flèches, des fois quand on a obtenu des échantillons Les échantillons de plasma sont identifiés par la lettre du patient et les derniers chiffres de l’année de collecte NNRTI, les inhibiteurs de la transcriptase inverse non nucléosidiques; Les INTI, les inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse; IP, inhibiteurs de la protéase

Tableau View largeTélécharger slideCaractéristiques des patients infectés par le VIH pendant le suivi de l’étude, y compris les substitutions d’acides aminés dans la protéase et la transcriptase inverseTable View largeTélécharger slideCaractéristiques des patients infectés par le VIH pendant le suivi de l’étude, y compris les substitutions d’acides aminés dans la protéase et transcriptase inverseConstruction du virus recombinant gag-pol Les virus recombinants ont été construits comme indiqué précédemment L’ARN viral a été extrait de Qiagen à partir d’échantillons de plasma, et l’amplification RT-PCR RT-PCR en une étape; Qiagen de position en pgag à ppol a été réalisée PCR produits ont été cotransfectés avec le vecteur de clonage pJMδGPRT pour la recombinaison homologue dans les cellules MT La production virale après transfection a été mesurée avec l’utilisation d’antigène p Innogenetics tous les jours Stocks viraux nouvellement générés ont été séquencés Clones L’ARN du VIH du patient A a été transcrit en sens inverse, amplifié par PCR et utilisé pour construire plusieurs clones contenant la région codante ‘-end de gag et pol dans le vecteur pIE. Le vecteur pIE est un plasmide à base de HIVNL qui a retiré le fragment ApaI site au site EcoRI et lui a substitué le fragment équivalent dérivé de pJMδGPRT , ce qui rend un plasmide VIHNL qui manque le ‘-end de gag, la protéase et la région codante de la transcriptase inverse Dix clones moléculaires obtenus en monothérapie avec zidovudine A et les clones obtenus pendant HAART A ont été transfectés par électroporation dans des cellules MT Production virale après transfection de chaque clone individuel a été suivi par l’antigène p dans les surnageants de culture. Des échantillons de plasma de génotypage et leurs stocks viraux recombinants correspondants ont été séquencés pour confirmer la présence dans les stocks viraux du même variant viral séquencé dans le plasma que la population réplique virale principale. Le patient A a été séquencé pour confirmer la présence de l’insert et pour évaluer la variation quasi-spécifique. L’analyse phylogénétique a confirmé que tous les échantillons d’un même patient étaient regroupés et excluaient la contamination croisée entre virus recombinants.Test de sensibilité aux médicaments Test de susceptibilité aux médicaments sur des surnageants de culture congelés de virus recombinant, au moyen d’un test de virus recombinant rapide PhenoSense HIV; ViroLogic Ce test implique la construction de vecteurs de test de résistance, qui sont constitués d’un pool de gag ‘-end recombinant contenant le VIH provenant de séquences p, protéase et reverse-transcriptase dérivées de l’échantillon viral en cours d’évaluation. Les vecteurs contiennent également un gène rapporteur de luciférase remplaçant env pour surveiller un seul cycle de réplication virale. La sensibilité des vecteurs de test de résistance à un panel de médicaments antirétroviraux a été comparée à un vecteur de référence contenant les séquences protéase et reverse-transcriptase dérivées de HIV-NL- Les capacités de réplication ont été mesurées à l’aide d’une version modifiée du test de sensibilité aux médicaments PhenoSense Les efficacités de réplication relatives des isolats ont également été mesurées en fonction du taux d’antigène p en culture. surnageants La constante de réplication K a été mesurée comme le temps en jours à atteindre, pg / mL d’antigène p après transfection L’efficacité de réplication relative des isolats a été déterminée à partir des rapports de K des virus recombinants Krv des patients sur K pour une souche sauvage VIH-NL Kwt et multiplié par un test d’infectiosité à cycle unique Infectivité des stocks viraux a été mesurée par le test d’infectivité à cycle unique dans des cellules GHOST-CXCR, comme décrit ailleurs avec modifications Un total de cellules / puits a été infecté en triple avec ng d’équivalent antigène p du virus en présence de μg de Polybrene / mL par spinoculation h à g et ° C La proportion de cellules positives à fluorescence verte a été mesurée par tri cellulaire activé par fluorescence Analyse FACS h après infectionAnalyses statistiques Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant GraphPad Prism, version GraphPad Software Les analyses de corrélation ont été estimées en utilisant Pearson test de corrélation Toutes les valeurs P ont été supprimées

Résultats

Paramètres cliniques La durée médiane du suivi clinique chez les patients de l’étude était de quatre ans. La charge virale plasmatique chez ces patients a diminué d’une médiane de log de copies de VIH-ARN / ml de gamme interquartile, – log de VIH-ARN copies / ml entre le début et la fin de la période d’étude, mais il n’a jamais atteint un niveau de & lt; copies / ml, malgré la survenue de multiples changements de traitement dans la poursuite de cet objectif. Néanmoins, les patients ont eu une augmentation médiane du nombre de cellules CD / μL par an, bien que cette augmentation n’ait pas été constante durant la période d’étude. La zidovudine en monothérapie pendant la première moitié de la s est ensuite passée à la bi-thérapie et, finalement, à la HAART, conformément aux directives de traitement du VIH. Tous les sujets ont été initialement traités par INTI. Les IP ont été introduits dans leurs traitements antirétroviraux. et, le changement était principalement associé à des augmentations significatives du nombre de cellules CD et à des réductions de la charge virale plasmatique; Plus tard, les INNTI ont été ajoutés aux traitements des patients Au moment où les derniers échantillons ont été obtenus, les patients avaient reçu une médiane de la gamme de médicaments antirétroviraux, – médicaments, y compris les médicaments inclus dans le régime thérapeutique le plus récentGénotypique et phénotypique Les échantillons de patients obtenus avant le traitement ou chez les patients recevant une monothérapie A, B, C et D portaient une médiane de mutations de résistance dans la transcriptase inverse et aucune mutation de résistance dans la protéase Après des commutations successives du traitement antirétroviral, aux derniers échantillons A, B, C et D, il y avait une augmentation du nombre médian de mutations de résistance primaire à pour la transcriptase inverse et pour la protéase. Les résultats des analyses phénotypiques étaient conformes avec les résultats génotypiques Ainsi, la sensibilité aux antirétroviraux a diminué en fonction du nombre de mutations Les virus recombinants obtenus avant le traitement et pendant la monothérapie sont restés sensibles à tous les médicaments antirétroviraux, à l’exception de la zidovudine. Cependant, les virus ultérieurs étaient totalement résistants à tous les INNTI, à tous les IP et à la plupart des INTI. le patient recevait une trithérapie qui consistait exclusivement en INTI, était multirésistante aux NRTI mais résistante aux IPN et aux INNTI selon le génotype plasmatique cinétique de p après la transfection La cinétique de production de l’antigène p après la transfection a révélé une réplication virale plus rapide Les virus recombinants A, C et D sont plus nombreux que les virus multirésistants. Les virus recombinants A, C et D produisent un taux de> pg / mL au lendemain de la transfection, similaire au VIH-NL-, tandis que leurs homologues multirésistants , C et D-D ont produit moins de temps À l’inverse, les virus multirésistants du patient BB ont produit des taux plus élevés d’antigène p après r transfection que son homologue de type sauvage B Deux des virus recombinants pour les patients D D et D ne se sont pas répliqués suffisamment pour obtenir des stocks viraux qui permettent d’autres expériences

Figure Déroulement Cinétique de réplication après transfection de MT avec virus recombinant La réplication virale a été mesurée par le niveau d’antigène p dans les surnageants de culture cellulaire tous les jours après transfection Ligne pointillée, pg de p par mL de surnageant de culture Les données ont été utilisées comme paramètre de réplication Les échantillons de Plasma K constants sont identifiés par la lettre du patient et les derniers chiffres de l’année de collecte. Figure Cinétique de réplication après transfection de MT avec virus recombinant La réplication virale a été mesurée par niveau d’antigène p dans les surnageants de culture cellulaire tous les jours après transfection. de p par ml de surnageant de culture Les données ont été utilisées comme paramètre de réplication pour calculer la constante de réplication K Les échantillons de plasma ont été identifiés avec la lettre du patient et les derniers chiffres de l’année de collecte.Tests de capacité de réplication test de réplication ViroLogic et le test d’infectivité dans les cellules GHOST-X Des résultats similaires ont été obtenus avec les deux tests. Les virus recombinants obtenus pendant les périodes de préthérapie ou de monothérapie ont une capacité de réplication et une infectiosité plus élevées que les virus recombinants multirésistants, à l’exception des virus. Le virus recombinant A a montré une meilleure capacité de réplication que son homologue A multirésistante dans le test de réplication à cycle unique, mais l’infectiosité des deux virus était similaire. Une corrélation significative a été trouvée entre les deux tests P = figure A, ainsi qu’entre le test de cycle de capacité de réplication et la constante de réplication K; P = figure B

Figure Vue grandDownload slideReplication capacity and infectivity assay Barres grises, virus récupérés avant le traitement ou pendant la monothérapie; barres blanches, virus obtenus plus tard Tous les résultats sont exprimés en pourcentages par rapport au test HIV-NL A, capacité de réplication à un cycle mesurée avec une modification du test PhenoSense ViroLogic B, Infectivité mesurée dans la lignée cellulaire GHOST-XFigure test d’infectiosité Barres grises, virus récupérés avant le traitement ou pendant la monothérapie; barres blanches, virus obtenus plus tard Tous les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport au test HIV-NL A, capacité de réplication à un cycle mesurée avec une modification du test PhenoSense ViroLogic B, Infectivité mesurée dans la lignée cellulaire GHOST-X

Visualisation large entre les tests de conditionnalité A, Corrélation entre la capacité de réplication et la constante d’efficacité de la réplication KB, Corrélation entre la capacité de réplication et infectivityFigure View largeTéléchargementCorrélation entre les tests de fitness A, Corrélation entre la capacité de réplication et la constante d’efficacité de réplication KB, Corrélation entre capacité de réplication et infectiosité Des clones viraux différents du patient A ont été construits contenant les régions codantes ‘-end de gag et pol dans le vecteur pIE. Des clones individuels ont été transfectés implantation. Quatre% des clones moléculaires obtenus pendant la zidovudine en monothérapie A produit un antigène p, tandis que seulement clones contenant des mutations multirésistantes à toutes les classes de médicaments On a séquencé un clone transgénique détectable d’antigène p transfecté pour observer si les clones qui ne se répliquaient pas ont une différence génotypique, par rapport aux clones qui produisent des niveaux détectables de p Le clone de l’échantillon A portait un codon stop à la position de la reverse-transcriptase, et le clone de l’échantillon A avait la substitution NS dans la protéase, qui a été associée à de graves défauts d’infectivité virale et de fitness CSMs dans thegaggene L’accumulation de mutations dans le gène gag a été associée à une récupération de la viralité dans un virus résistant aux inhibiteurs de protéase. Nous avons séquencé le fragment gag-p en gag-p du virus recombinant obtenu, afin d’évaluer l’émergence des CSM et non-CSM pendant le traitement antirétroviral figure A Il y avait une grande variation des mutations gag pour les virus multirésistants, comparé aux virus antérieurs correspondants Prise individuelle, mutations sélectionnées par traitement antirétroviral AV au site de clivage p / p développé chez le patient C figure B , ainsi que ML et VA dans la table de protéase PL au site de clivage p / p développé chez le patient D, concomitamment à la sélection de la protéase IV Enfin, prot Faciliter les mutations choisies par l’inhibiteur PS et AN au clivage p / p survenant lorsque des inhibiteurs de protéase ont été introduits dans la thérapie du patient D Dans cette analyse, nous avons trouvé que% des virus séquencés contenaient des insertions précédemment rapportées dans p Cinq virus B, B, D, D, et D portaient une duplication des acides aminés APP dans le motif p Le virus Patient D a également sélectionné une insertion d’acide aminé E en position de p Le sixième virus C a sélectionné des insertions dans p sur traitement: une à la position SRLE, et l’autre QKQG contigu au motif KQE Il n’y a pas d’association apparente entre ces insertions et le traitement, bien que le nombre d’échantillons dans notre étude soit petit

Figure Vue grandDownload slideClauses de site de clivage et de non-clivage A, Représentation schématique des gènes gag et gag-pol Flèches sous les gènes figure, gag et gag-pol; lignes pointillées entre les flèches, zone de décalage de trame pour gag et gag-pol; triangles pleins, sites de clivage p / p, p / p, et p / p B, gag Séquences d’un virus recombinant L’alignement a été fait selon la séquence de référence HIV-NL Cases grises, sites de clivage pour consensus de séquence VIH-NL; des boîtes creuses, des variations des sites de clivage et des sites sans clivage, en ce qui concerne les variations VIH-NL précédemment documentées dans la bibliographie scientifique CA, capside; TF, trame trans; PR, protéase; RT, transcriptase inverse; IN, intégraseFigure View largeTélécharger slide Mutations du site de clivage et du site de non-clivage A, Représentation schématique des gènes gag et gag-pol Flèches sous les gènes figure, gag et gag-pol; lignes pointillées entre les flèches, zone de décalage de trame pour gag et gag-pol; triangles pleins, sites de clivage p / p, p / p, et p / p B, gag Séquences d’un virus recombinant L’alignement a été fait selon la séquence de référence HIV-NL Cases grises, sites de clivage pour consensus de séquence VIH-NL; des boîtes creuses, des variations des sites de clivage et des sites sans clivage, en ce qui concerne les variations VIH-NL précédemment documentées dans la bibliographie scientifique CA, capside; TF, trame trans; PR, protéase; RT, transcriptase inverse; IN, intégrase

Discussion

Étant donné que de nombreux facteurs entrent en ligne de compte dans le développement de dosages comparatifs adéquats, la cohérence entre les différents types d’expériences de fitness utilisées est importante, car nous avons utilisé exclusivement des virus chimériques, Nous ne pouvons pas exclure que les isolats multirésistants aient une infectivité et une cinétique de croissance altérées par rapport aux virus sensibles aux médicaments, comme le montre le contexte de l’infection primaire au VIH . L’accumulation de mutations pourrait entraîner non seulement des virus hautement infirmes. , dans le cas du patient A, nous avons observé une réduction de l’efficacité de la transfection à un seul clone concomitante avec la capacité de réplication. Certains changements dans les clones transfectés pourraient être liés à des déterminants génotypiques associés à de graves défauts d’infectivité et de forme physique. de la mutation NS dans le gène de la protéase ou le pr présence d’un codon stop dans le gène de la transcriptase inverse, soit à la suite de polymérases virales ou de polymérases à base de PCR in vitro. Cependant, la plupart des séquences clonales présentaient un motif mutationnel complexe dans la protéase et la reverse-transcriptase, L’accumulation de mutations pendant l’échec du traitement pourrait entraîner une diminution du nombre de clones viraux viables après la transfection, ce qui suggère une diminution de la population virale efficace après de nombreuses années de traitement. Cette réduction de la viabilité virale pourrait également être associé à une augmentation du taux de mutagenèse par une pression médicamenteuse continue, réduisant la forme et l’infectivité, et contribuant également à une réduction du pool de cellules CD infectées. Des réductions de la population de virus efficace associées à la pression médicamenteuse ont déjà été signalées. virus de la fièvre aphteuse Bien que les modèles de mutations impliqués dans la réplication capa les changements de ville ne sont pas clairement définis, il a été proposé que la coévolution pol et gag joue un rôle important chez les patients recevant un traitement antirétroviral La sélection de mutations dans gag à la fois CSM et non-CSM a été précédemment décrite comme un moyen d’améliorer la virulence dans les virus hautement résistants [, -] Le CSM AV a été associé à des mutations de résistance aux inhibiteurs de protéase aux codons et , alors que PL peut diriger la voie de résistance aux protéases par IV plutôt que par mutation VA , en accord avec L’APP-duplication des acides aminés dans le motif pGag PTAP riche en proline, qui interagit avec les protéines cellulaires cruciales pour le bourgeonnement viral, a été associée à une augmentation de l’infectiosité et de la résistance aux INTI , ce qui est compatible avec son apparition avant l’introduction des inhibiteurs de la protéase dans les régimes de traitement des patients B et D Cette insertion, ainsi qu’une insertion similaire à la SRLE développée chez le patient C, ont été récemment associée à la restauration de la capacité de réplication réduite dans les virus multirésistants Bien que la présence de l’APP dans pgag dans les virus recombinants du patient B puisse être liée à l’augmentation de la capacité de réplication observée dans le virus multirésistant B au virus B de prétraitement, l’émergence de la même insertion dans le virus recombinant D ne semble pas compenser la sélection des mutations associées à la thymidine et les virus recombinants multirésistants à la transcriptase inverse MV récupérés chez les patients A, C et D n’a pas récupéré la capacité de réplication à des niveaux similaires ou supérieurs à ceux des virus antérieurs, malgré une accumulation de CSM et de non-CSM. En revanche, le virus multirésistant du patient B avait une capacité de réplication améliorée, par rapport au virus prétraitement. les non-CSMs KG et GR ont émergé pendant le traitement, mais il n’a pas été indiqué si ces mutations pourraient jouer un rôle de réplique Bien que nous nous soyons concentrés sur le rôle de gag et de pol dans la capacité de réplication, l’évolution du nombre de cellules CD et de la charge virale chez ces patients pourrait être, en partie, une conséquence des interactions complexes entre le virus et l’hôte. ou nos réponses immunitaires adaptatives, qui vont au-delà de la portée de cette étude. Nos découvertes remettent en question l’idée que l’accumulation de mutations pharmacorésistantes au cours du traitement antirétroviral à long terme entraîne inévitablement des virus dont la forme physique est altérée. La modification de la capacité de réplication et de l’infectiosité serait modulée par la pression du médicament et les interactions virus-hôte joueraient un rôle important dans le maintien de l’état immunologique. Par conséquent, les avantages thérapeutiques du verrouillage du génome du virus les mutations pharmacorésistantes, qui altèrent la capacité virale, demeurent spéculatif

Remerciements

Soutien financier Contrat FIS du Ministère de la Santé espagnol / [à JM-P] et octroi de BEFI / [au JGP], et le Réseau espagnol SIDA « Red Temática Cooperativa de Investigación en SIDA » G / Red, et Fundación para la Investigación y Prevención del Subvention de SIDA en España / Conflits d’intérêts potentiels NTP est un employé de ViroLogic BC a reçu une subvention de Bristol-Myers Squibb, Gilead, Roche et Bayer LD a été consultant pour Bayer JMP a reçu des honoraires pour avoir pris la parole dans des programmes éducatifs soutenus par GlaxoSmithKline JGP: aucun conflit

Maria Selma Restaurant, LLC – 1617 Richmond Ave, Houston Tx 77006
Website Developed by: E-nnovations Technologies and Marketing LLC