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Profil de Superantigène des isolats de Staphylococcus aureus provenant de patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes

Les superantigènes induisent des réponses inflammatoires cutanées dans la dermatite atopique, souvent associée à l’infection à Staphylococcus aureus. Les cellules T activées in vitro par des superantigènes deviennent résistantes aux stéroïdes. L’objectif était d’évaluer les profils superantigènes des isolats de S aureus chez des patients présentant une dermatite atopique résistante aux stéroïdes. la capacité de production de superantigène d’isolats de S aureus de 78 patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes groupe 1 avec celle de 30 isolats vaginaux de femmes en bonne santé groupe 2 et 22 isolats d’une population générale de patients atteints de dermatite atopique groupe 3 réaction en chaîne polymérase avec amorces pour les superantigènes, combiné à des tests d’anticorps sélectionnés, a été utilisé pour analyser la présence de toxine du syndrome de choc toxique 1, d’entérotoxines staphylococciques et de superantigènes entérotoxiniques. Les isolats de S. aureus du groupe 1 présentaient une différence statistiquement significative dans le profil du superantigène. isolats du groupe 2 et du groupe 3 Les isolats du groupe 2 étaient similaires du profil aux isolats du groupe 3, avec 4 et 5 superantigènes par isolat, respectivement Par contraste, les isolats du groupe 1 produisaient en moyenne 8 superantigènes P1 001, pour comparaison avec le groupe 2 ou groupe 3 Ces isolats du groupe 1 étaient plus susceptibles de produire les toxines du syndrome de choc toxique 1, de l’entérotoxine B staphylococcique B et de l’entérotoxine C staphylococcique et de produire des combinaisons inhabituelles de superantigènes, par exemple toxine du syndrome de choc toxique 1 et Entérotoxines staphylococciques BConclusions Les isolats de S. aureus provenant de patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes semblent être sélectionnés sur la base d’une production accrue de superantigènes comparés à ceux des isolats des groupes témoins. Les superantigènes peuvent offrir des avantages sélectifs pour la colonisation des patients.

Staphylococcus aureus est un organisme commensal qui colonise jusqu’à 50% des humains [1, 2] L’organisme colonise le plus souvent les narines antérieures et, de là, peut coloniser d’autres surfaces corporelles, y compris d’autres muqueuses et la peau endommagée. La capacité de S aureus à provoquer des maladies humaines dépend de la production d’adhésines de surface cellulaire, de facteurs antiphagocytaires et d’exotoxines sécrétées, dont les fonctions semblent à la fois assurer la sécurité des microbes et retarder la fonction du système immunitaire [10-12] Parmi les facteurs sécrétés figure une grande famille d’exotoxines de superantigène [8] Les superantigènes staphylococciques comprennent les entérotoxines staphylococciques, classiquement les causes courantes d’intoxication alimentaire et TSS non-menstruel, et TSST-1 toxine TSS, la cause des TSS menstruels et non-menstruels [8] sérotypes d’entérotoxine staphylococcique A-E SEA-SEE et S EG-SEQ ont été bien décrits dans la littérature SEA-SEE et SEI sont capables de provoquer des vomissements et des diarrhées lorsqu’ils sont administrés à des singes et sont donc correctement dénommés entérotoxines staphylococciques [13] Les entérotoxines staphylococciques restantes manquent d’activité émétique SEG, SEK, SEL, et SEQ ou n’ont pas été testés pour l’activité émétique Selon les suggestions d’un comité de nomenclature récent, ces superantigènes sont plus correctement désignés comme SEP-SE, G, -H, -J, -K, – comme des entérotoxines staphylococciques. L, -M, -N, -O, -P et -Q [14] Les superantigènes sont définis par leur capacité à stimuler la libération de cytokines à la fois des lymphocytes T et des macrophages [15] Les protéines se lient à des régions relativement invariantes du complexe majeur d’histocompatibilité II molécules sur les cellules présentatrices d’antigène, et ils croisent avec certaines régions variables des chaînes bêta des récepteurs des lymphocytes T Vβ-TCR [16] Chaque superantigène a un sous-ensemble relativement unique d’interactions Vβ-TCR Par exemple, TSST-1 sti mulates seulement les lymphocytes T portant Vβ2-TCR, mais ceux-ci représentent seulement ~ 10% du répertoire total des lymphocytes T chez l’homme [16] Cependant, au cours de TSS aigu, les cellules T portant Vβ2-TCRs peuvent proliférer de manière asymétrique, telle que les cellules T activées représentent 60% des lymphocytes T des patients [17]. La libération massive de cytokines par les lymphocytes T et les macrophages est à l’origine des manifestations les plus sévères des maladies à médiation par superantigène [8, 15, 16]. Affections cutanées à médiation cellulaire T pouvant compromettre considérablement la qualité de vie, car les patients souffrent de troubles du sommeil, de gêne sociale et de détresse émotionnelle L’infection à S aureus contribue à l’aggravation de l’inflammation cutanée dans la dermatite atopique [18-20] produire des superantigènes, y compris SEA, SEB, SEC et TSST-1 Cependant, le spectre complet des superantigènes produits par les isolats de S aureus qui infectent les patients atteints de dermatite atopique n’a pas été examiné précédemment. Il a été démontré que les perantigènes induisent la résistance des cellules T aux corticostéroïdes in vitro [21]. Cela pourrait contribuer à la prise en charge de la dermatite atopique, car les corticostéroïdes topiques sont les médicaments les plus couramment utilisés pour le traitement de la dermatite atopique. caractérisent les isolats de S aureus provenant de patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes en ce qui concerne leur capacité à produire des superantigènes

Matériaux et méthodes

Isolats de S aureus Trois groupes d’isolats ont été comparés pour la présence de gènes de superantigène. Isolats du groupe 1 inclus 78 isolats de patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes La résistance aux stéroïdes a été définie par une réduction de 35% de la zone d’eczéma et de l’indice de sévérité du patient. avec un stéroïde topique, prednicarbate crème émolliente, deux fois par jour pendant au moins 12 jours Des cotons-tiges ont été utilisés pour obtenir des échantillons individuels des 4 lésions eczémateuses les plus touchées, qui ont été évalués pour la croissance des colonies S aureus. morphologie des colonies gram positif, cocci formant des grappes, activité de catalase positive et activité coagulase positive Les isolats du groupe 2 à titre de comparaison comprenaient 30 isolats vaginaux de femmes en bonne santé recueillis au hasard en 2003-2005 et publiés antérieurement [22] en 2002 d’une population générale de patients atteints de dermatite atopique, quelle que soit la réponse au traitement Pour le test du gène superantigène, tous les organismes ont été cultivés à 37 ° C avec agitation à 200 tr / min dans 10 ml de bouillon Todd Hewitt puis utilisés pour l’extraction de l’ADN [22] Les amorces utilisées pour l’amplification PCR du superantigène [22] Pour l’utilisation dans la quantification de superantigènes sélectionnés, les organismes ont été cultivés dans un milieu de boeuf dialyzable milieu 25 ml dans des erlenmeyers de 125 ml à 37 ° C avec agitation à 200 tr / min [23]; les superantigènes inclus TSST-1, SEA, SEB et SEC Superantigènes dans ces échantillons ont été concentrés 10-100 fois par précipitation consécutive avec l’addition de 4 volumes d’éthanol absolu pendant 2 h, centrifugation à 4000 g pendant 10 min, et resolubilisation dans l’eau distillée [23] Les superantigènes ont été quantifiés par des tests d’anticorps immunoblotting Western avec l’utilisation d’antisérums de lapin polyclonal dirigé contre les superantigènes individuels [24] En bref, les quantités connues de superantigènes purifiés normes 01, 001 et 0001 ug / mL, purifié dans le laboratoire de PMS et de fluides de culture concentrés ont été soumis à une électrophorèse sur du dodécylsulfate de sodium sur des gels de polyacrylamide à 10% et ont été transférés sur des membranes en polyvinylidène Bio-Rad Laboratories Par la suite, les membranes ont été bloquées avec 1% d’albumine. élevé dans le laboratoire de PMS ou fourni par Toxin Technology aux superantigènes individuels, ont été lavés pour enlever antise non liée ra, ont été incubés pendant 2 h avec une molécule entière d’IgG anti-lapin conjuguée à la phosphatase alcaline; Sigma Aldrich, ont été lavés pour éliminer conjugué non lié, et ont été développés avec substrat Les densités de bande sur les immunoblots développés ont été déterminées à l’aide d’un programme informatique fourni par les National Institutes of Health ImageJ, version 134S [25] 10 ng / mL de l’échantillon 001 pg / mL dans des liquides de culture concentrés 100 fois. Études de srrA-srrB au cours de l’évaluation de la production de superantigène par des isolats de S. aureus provenant de patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes. Les profils de production de superantigène et les quantités produites semblaient déréglés Ainsi, nous avons évalué le système régulateur à 2 composants de la réponse respiratoire staphylococcique SrrA-SrrB pour une régulation altérée de la production de superantigène SrrA-SrrB réprime la production d’exotoxine dans des conditions de faible oxygène l’activité de répression lorsque les niveaux d’oxygène dépassent 2%, et semble réguler d’autres systèmes de régulation mondiaux critiques, s uch comme régulateur génique accessoire [26, 27] Le locus srrA-srrB a été séquencé chez 6 isolats de patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes, pour évaluer la fonction de ce système régulateur [28]

Résultats

Nous avons comparé, par PCR, les profils superantigènes de 2 groupes d’isolats: 30 isolats vaginaux précédemment publiés chez des femmes en bonne santé [22] et 22 isolats d’une population générale de patients atteints de dermatite atopique Nous avons évalué la capacité des isolats à produire TSST-1, SEA-SEE, SEI, SEl-G, SEl-H, SEl-L, SEl-M, SEl-N, SEl-O et SEl-Q par PCR pour le tableau de gènes 1 respectif; la séquence nucléotidique du gène sel-P n’est disponible que lorsque cette étude est presque terminée; Le superantigène SEl-P a été omis de l’étude Plusieurs observations importantes ont été faites par rapport aux 3 groupes d’isolats La capacité des isolats du groupe 1 provenant de patients résistants aux stéroïdes à produire des superantigènes différait significativement de celle des isolats du groupe 2 isolats vaginaux Les isolats du groupe 1 et ceux du groupe 3 d’une population générale de patients atteints de dermatite atopique étaient significativement plus susceptibles d’avoir les gènes suivants: SEA, SEB, SED, SEl-H, SEl-J, SEl-M, SEl-N, et SEl-O que les isolats des groupes 2 et 3 étaient également plus susceptibles que les isolats du groupe 2 d’avoir les gènes SEE, SEG et SEl-L et étaient plus susceptibles que les isolats du groupe 3 d’avoir le gène SEl-K Il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre les 3 groupes pour les gènes SEC, SEI, SEl-Q et TSST-1. Les isolats du groupe 2 n’étaient pas significativement différents dans le profil superantigène que les isolats du groupe 3; à l’exception que les isolats du groupe 2 présentaient significativement plus souvent les gènes SEl-K et SEl-L que les isolats du groupe 3 P1 001 Comme le montre le tableau 2, les isolats du groupe 1 ont produit en moyenne 8 superantigènes; seulement 1 isolat n’a pas produit de superantigène connu et 1 isolat avait les gènes de tous les superantigènes connus sauf TSST-1. Par contre, les isolats des groupes 2 et 3 ont produit une moyenne de 5 et 4 superantigènes, respectivement la différence n’était pas statistiquement significative. , tous deux significativement inférieurs à ceux produits par les isolats du groupe 1 Un isolat du groupe 2 et 3 isolats du groupe 3 étaient négatifs pour les superantigènes connus

Tableau 1View largeTélécharger slideSuperantigène gènes dans les isolats de Staphylococcus aureus provenant de patients atteints de dermatite atopique résistant aux stéroïdes AD groupe 1, isolats vaginaux du groupe 2 des femmes en bonne santé, et isolats d’une population générale de patients atteints de groupe AD 3Table 1View largeDownloaderSuperantigen gènes dans les isolats de Staphylococcus aureus de patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes, groupe AD 1, isolats vaginaux du groupe 2 en bonne santé et isolats d’une population générale de patients atteints du groupe AD 3

Comparaison de la production de superantigène parmi les isolats de Staphylococcus aureus provenant de patients atteints de dermatite atopique et d’isolats vaginaux S aureusTable 2View largeTéléchargementComparaison de la production de superantigène parmi les isolats de Staphylococcus aureus provenant de patients atteints de dermatite atopique AD et d’isolats vaginaux S aureusPlusieurs autres observations intéressantes ont été faites concernant le Les isolats du groupe 1 du tableau 3 SEl-G, SEl-M, SEl-N, SEl-O et SEI seraient liés, dans l’ordre, à un groupe de gènes d’entérotoxines [29] Parmi les isolats du groupe 1, seulement 19 24% En revanche, 63 81% des isolats contenaient les gènes d’au moins 1 superantigène dans la grappe, ce qui suggère que la grappe des entérotoxines n’est pas intacte dans la majorité de ces isolats. Dans des tests sur> 5000 isolats de TSS, seulement 2 ont été montrés par le laboratoire de PMS pour produire la combinaison de SEB et SEC Des 78 isolats du groupe 1, 12 15% étaient positifs pour les gènes à la fois t De même, on pense généralement que les souches de S aureus ne peuvent pas produire SEB et TSST-1 simultanément [30-32] Cependant, 8 10% des isolats du groupe 1 étaient positifs pour ces deux toxines Environ 15% des isolats de S aureus provenant de patients atteints de TSS ont ensemble les gènes SEC et TSST-1 [33]; les trois principales causes de TSS staphylococcique sont TSST-1, SEB et SEC [8, 32] Parmi les isolats du groupe 1, 57 73% étaient positifs pour ⩾1 de ces toxines

Tableau 3View largeTélécharger des combinaisons de superantigènes spécifiques dans des isolats de Staphylococcus aureus provenant de patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes 1Table 3View largeTélécharger Des combinaisons spécifiques de superantigènes dans des isolats de Staphylococcus aureus provenant de patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes 1TSST-1, SEB et SEC ont été quantifiées. culture in vitro pour évaluer les différences potentielles dans la quantité de ces superantigènes produits par les isolats du groupe 1, du groupe 2 et du groupe 3 Il n’y avait aucune différence entre les groupes quant aux quantités de superantigènes produites dans les milieux de culture; la fourchette de valeurs était de 3-20 μg / mL pour TSST-1, de 25-80 μg / mL pour SEB et de 40-80 μg / mL pour SEC. Fait intéressant, au cours de ces études, il est apparu que les isolats du groupe 3 produits À la lumière de cette observation, 3 des isolats du groupe 1, y compris l’isolat qui contenait les gènes de tous les superantigènes connus à l’exception du TSST-1, ont été comparés à 3 isolats du SEA. Isolats TSS pour les caractéristiques de croissance et de production de superantigène, en particulier pour SEA figure 1 Les isolats menstruels TSS ont augmenté à des densités cellulaires légèrement plus élevées dans la période d’essai de 12 h, comparés aux isolats du groupe 1 Tous les isolats TSS menstruels ont produit TSST- 1 et SEA, avec TSST-1 produit principalement en phase postponponentielle et avec SEA produit principalement pendant la croissance exponentielle Ces données sont cohérentes avec celles des études précédentes [10, 34, 35] En revanche, les 3 isolats de dermatite atopique ont produit SEB et SEC à haute concentration Les isolats ont produit une SEA à des concentrations plus élevées que les isolats TSS menstruels à raison de 10 μg / mL par rapport à 01 μg / mL, et l’EES a été produite principalement pendant la phase postponponale déficit immunitaire. Ces études ont suggéré que les isolats du groupe 1 non seulement produit des combinaisons inhabituelles de superantigènes tableau 3, mais aussi une production d’ASE dérégulée, par rapport à d’autres isolats

Figure 1Voir grand Diapositive Croissance d’isolats de Staphylococcus aureus et production de superantigènes in vitro A, Croissance moyenne de 3 isolats provenant de patients atteints du syndrome de choc toxique menstruel TSS, comparée à la croissance moyenne de 3 isolats provenant de patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes B, Production moyenne de carrés noircis de la toxine TSS 1 et d’entérotoxine staphylococcique SE Carrés non brûlés du sérotype A par les mêmes 3 isolats TSS menstruels, Production moyenne de carrés noircis SEB, de triangles noircis SEC et de carrés non éclaircis SEA par 3 isolats de patients avec stéroïdes- Dermite atopique résistante Les barres représentent les SD de la CFU moyenne, unités formant des coloniesFigure 1View largeTélécharger DiapositiveGrowth of Staphylococcus aureus isolats et production de superantigènes in vitro A, Croissance moyenne de 3 isolats de patients atteints du syndrome de choc toxique menstruel TSS carrés noircis, comparé à la moyenne croissance de 3 isolats de patients avec stéroïde-r B, Production moyenne de carrés noircis de la toxine TSS 1 et d’entérotoxine staphylococcique SE Carrés non brûlés de sérotype A par les mêmes 3 isolats TSS menstruels, Production moyenne de carrés noircis SEB, de triangles noircis SEC et de carrés non éclaircis SEA par 3 isolats chez les patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes Les barres représentent les SD de la CFU moyenne, unités formant des coloniesSrrA-SrrB est un régulateur systémique global à 2 composants de la production d’exotoxines en S aureus [26, 27] Ce système réprime la production de superantigène conditions d’oxygène, niveau d’oxygène, <2%; son activité est perdue en présence d'oxygène [26, 27] Le système à 2 composants a été séquencé dans 6 isolats du groupe 1; Parmi les 6 isolats testés, 2 étaient déficients dans leur capacité à produire Srr à cause des troncatures dans le locus srrA-srrB [28]

Discussion

Les superantigènes de S aureus jouent un rôle important dans l’évolution naturelle de la dermatite atopique [18-20] Les études précédentes se sont concentrées sur quelques superantigènes produits par des souches de S aureus obtenues chez des patients atteints de dermatite atopique. Les patients atteints de dermatite atopique ont examiné tous les superantigènes bien caractérisés sauf SEl-P, qui est un superantigène rare. Plusieurs observations importantes ont été faites. Premièrement, les souches S aureus de patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes ont montré leur capacité à produire un grand nombre de superantigènes. organisme, significativement plus élevé que ceux produits par d’autres isolats cutanés isolats du groupe 3 provenant d’une population générale avec dermatite atopique et isolats muqueux du groupe 2 isolats vaginaux Chaque superantigène est connu pour activer seulement un sous-ensemble de lymphocytes T exprimant des régions Vβ-TCR particulières [15] , 16] L’effet net des souches de S aureus produisant un plus grand nombre de super types d’antigènes serait de recruter un plus grand nombre de cellules T pour produire des cytokines pro-inflammatoires et d’induire un spectre plus large de lymphocytes T qui ne répondent pas aux effets immunosuppresseurs des corticostéroïdes. Ce processus pourrait contribuer à la dermatite atopique résistante aux stéroïdes. les isolats de S aureus provenant de patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes ont été sélectionnés pour leur production d’un plus grand nombre de superantigènes que ceux produits par des isolats d’une population générale de patients atteints de dermatite atopique et par des isolats vaginaux de femmes normales en bonne santé. la sélection est inconnue, l’utilisation de stéroïdes pour traiter la dermatite atopique, avec l’intention de réduire l’inflammation et les dommages cutanés conséquents, créerait typiquement des environnements cutanés qui réduisent la colonisation de S aureus. La production accrue de superantigène par des organismes individuels peut être nécessaire pour promouvoir l’inflammation cutanée et staphylococcique continue infectieuse Chez les patients atteints de dermatite atopique, les approches de traitement antimicrobien, y compris le traitement antibiotique, utilisées pour la prise en charge de la dermatite atopique devraient être étudiées afin de déterminer leur biais de sélection pour de telles souches de S aureusThird, en plus de pouvoir produire davantage de superantigènes. Les isolats de S aureus provenant de patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes ont également une production dérégulée de superantigènes et produisent des combinaisons inhabituelles de superantigènes. Par exemple, on suppose généralement que les souches S aureus ne peuvent produire ensemble les superantigènes TSST-1 et SEB. les îles qui codent les toxines peuvent occuper la même position chromosomique [30-32] Ce n’est clairement pas le cas, car plusieurs isolats de patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes coproduisent les deux superantigènes. En outre, la production de superantigène est strictement contrôlée régulateur SrrA-SrrB [12, 27] Ce 2-compo Ses fonctions répressives sont perdues en présence de> 2% d’oxygène [36] Ainsi, S aureus ne produit pas de superantigènes dans des conditions anaérobies, malgré la présence de l’organisme. Nous avons observé que 2 des 6 isolats de S aureus avaient des gènes tronqués pour SrrA-SrrB. Ces souches sont capables de produire des superantigènes, même dans des conditions défavorables et à faible teneur en oxygène [28] Nous avons montré que les isolats de S aureus la dermatite atopique résistante est plus susceptible que les autres isolats de S aureus de produire les superantigènes habituellement fabriqués à des concentrations élevées, telles que TSST-1, SEB et SEC. En outre, les organismes produisent de l’EES en phase postponponentielle lorsque les densités bactériennes sont élevées. dans la phase exponentielle [10, 34], donnant à ces organismes la capacité de faire des concentrations plus élevées de ce superantigène que ce qui serait attendu Enfin, nos études montrent que p La formation de superantigènes, tels que le groupe de gènes entérotoxine [29] des protéines SEl-G, SEl-M, SEl-N, SEl-O et SEI, a été altérée. Dans de nombreuses souches, ces superantigènes ne sont plus liés Collectivement, la présente étude suggère que les isolats de S. aureus provenant de patients atteints de dermatite atopique résistante aux stéroïdes sont sélectionnés pour leur plus grande capacité à produire des superantigènes. Ces protéines sont des facteurs de virulence critiques pour les souches de S. aureus. Par exemple, une souche TSST-1-positive, sans un système SrrA-SrrB fonctionnel, pourrait causer des TSS vaginales menstruelles sans tenir compte de la teneur en oxygène du vagin. On a émis l’hypothèse que l’association de tampons avec TSS est liée à leur oxygénation d’un environnement typiquement anaérobie [37, 38] Chez les individus avec des souches TSST-1-positives, TSS peut se produire en l’absence de tampon nous e

Remerciements

Soutien financier de Novartis Pharmaceutical Corporation à PMS et DYML; Subvention NIH des Instituts nationaux de la santé AI074283 à PMS; L’Institut national des allergies et des maladies infectieuses, les NIH N01 AI40029, N01 AI40030, et AR41256 à DYML; Le Centre de recherche clinique général accorde le MO1 RR00051 de la Division des ressources de la recherche au DYML; et la chaire familiale Edelstein en allergie pédiatrique et immunologie aux conflits d’intérêts DYMLPotential BBA est un employé de Novartis Pharmaceutical Corporation PMS et DYML ont reçu un financement partiel pour cette étude de Novartis Pharmaceutical Corporation LCC et KLS: aucun conflit

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