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Vaccination de souris et de bovins avec de l’ADN plasmidique codant pour l’antigène Mycobacterium bovis MPB

Un examen scientifique de la tuberculose bovine en Grande-Bretagne a conclu que le développement d’un vaccin bovin offre les meilleures perspectives pour le contrôle à long terme des maladies Des rapports récents de vaccination réussie contre Mycobacterium tuberculosis dans des modèles animaux ont soulevé la possibilité d’utiliser une stratégie similaire Pour tester cette possibilité, des souris BALB / c ont été immunisées avec de l’ADN codant pour l’antigène M bovis MPB. Les souris ont répondu à la vaccination avec une réponse IgG / IgGa mixte à l’antigène et ont été protégées de la provocation intraveineuse par des anticorps anti-Mycobacterium bovis. L’immunogénicité du vaccin ADN chez les bovins a été testée, après avoir établi que l’ADN codant pour le MPB était immunogène et induit une immunité protectrice chez la souris. Dans ces études, les animaux vaccinés ont eu une prolifération forte. réponses à MPB

Dans les pays développés, l’introduction de la pasteurisation du lait et le contrôle de la tuberculose bovine par des mesures de contrôle et d’abattage ont considérablement réduit la transmission de l’infection à Mycobacterium bovis du bétail aux humains. Dans ces pays, M bovis est aujourd’hui principalement une zoonose professionnelle. En revanche, la tuberculose humaine causée par M bovis est toujours un problème de santé majeur dans de nombreux pays en développement Un certain nombre de facteurs maintiennent la menace de la tuberculose bovine pour la santé humaine, y compris l’augmentation du nombre de personnes immunodéprimées , l’émergence de souches de M bovis résistantes aux médicaments connus et, dans certains pays, une prévalence croissante des maladies chez les bovins La tuberculose bovine a également de graves conséquences pour le bien-être animal, et les exploitations touchées subissent des pertes économiques douloureuses En Grande-Bretagne, un récent examen scientifique indépendant pour le gouvernement a conclu que de nouvelles mesures de lutte sont nécessaires pour lutter contre l’incidence croissante de la tuberculose dans le cheptel britannique et que la meilleure perspective pour un contrôle futur est de mettre au point un vaccin pour protéger les bovins contre la tuberculose plasmatique. un vaccin contre M bovis qui est au moins aussi protecteur que le BCG mais qui ne compromet pas le test cutané à la tuberculine À ce jour, peu de cas d’immunisation par ADN ont été signalés pour des espèces animales telles que les bovins. Cox et al ont immunisé les bovins avec des plasmides codant pour les glycoprotéines BHV de l’herpès bovin et ont rapporté des réponses d’anticorps neutralisant les virus qui limitaient l’excrétion de BHV des veaux vaccinés.Dans cette étude, nous avons utilisé un vaccin ADN qui code l’antigène M bovis. MPB, qui est reconnu par les deux bras humoraux et cellulaires de la réponse immunitaire au cours de l’infection M bovis chez les bovins Nous rapportons que BALB / cm la glace immunisée avec l’ADN codant pour le MPB avait une réponse IgG et / ou IgGa mixte et était protégée contre la provocation intraveineuse avec M bovis virulent dans une mesure similaire à celle vaccinée avec le BCG. En outre, les bovins immunisés avec le vaccin ADN donnaient de fortes réponses proliferatives. après stimulation avec une protéine MPB recombinante

Matériaux et méthodes

ga dose de vaccination des souris immunisées par l’ADN × cfu a reçu un μg d’inoculum μg dans le muscle quadriceps de chaque patte arrière μg total au début de l’expérience et par la suite, à des semaines d’intervalle M bovis challenge chez la souris Pour des études ultérieures de vaccination et de provocation, toutes les souris ont été soumises à une épreuve iv avec un cfu de souche M bovis / jours après l’immunisation finale par ADN. Des souris ont été sacrifiées plusieurs semaines après l’infection par M bovis. Les tissus ont été homogénéisés à l’aide d’un système de macérateur à lame rotative. Des numérations viables ont été effectuées sur le macérat par dilution en série dans de l’eau distillée stérile et placage de dilutions sur la gélose Middlebrook H Difco, Detroit contenant pyruvate de sodium g / L et% v / v oléate Middlebrook / plaques d’enrichissement ADC ont été incubés à ° C et ont été examinés après des semaines pour la croissance de M bovis Le nombre de colo Le test U de Mann-Whitney a été utilisé pour toutes les analyses statistiques ultérieures. Vaccination des bovins Trois veaux femelles de ~ mois ont été immunisés soit par pCMV soit par pCMV-link Chaque groupe d’animaux reçu Antigens tuberculine bovine PPD-M a été obtenue à partir de l’unité de production de tuberculine à Veterinary Laboratories Agency Weybridge Surrey, Royaume-Uni et a été utilisé dans la culture à une concentration de μg / ml La forme glycosylée native de MPB On a purifié à partir de M bovis AN par Chromatographie d’affinité ConA, comme décrit par ailleurs On a obtenu le MPB recombinant non glycosylé en clonant le gène qui code MPB de M bovis dans le vecteur d’expression pETd En utilisant ce vecteur, MPB a été exprimé chez Escherichia coli comme la protéine de fusion marquée à l’histidine de kDa et purifiée en utilisant la chromatographie d’affinité au Ni, comme décrit par le fabricant Novagen, Madison, W I La pureté du MPB recombinant a été confirmée avec un antisérum polyclonal de lapin contre les protéines E coli Dako, High Wycombe, Royaume-Uni; données non montrées La figure montre à la fois des formes recombinantes et natives de MPB par SDS PAGE et leur reconnaissance par l’anticorps monoclonal SB MAB M; Agen Biomedical, Acacia Ridge, Australie SB est spécifique du MPB et de l’antigène M bovis étroitement apparenté MPB La glycoprotéine native MPB a migré vers une position de kDa et a été reconnue par SB L’autre bande de poids moléculaire plus élevé ~ kDa visible par SDS PAGE est un monomère ConA, un contaminant inévitable résultant des données finales de l’étape de purification ConA non représenté. La forme native de MPB a été utilisée en ELISA indirect pour s’assurer que tous les epitopes conformationnels natifs seraient disponibles pour la reconnaissance. Pour cette raison, le MPB recombinant purifié par affinité a été utilisé. Du sang ELISA indirect a été prélevé sur des souris dans tous les groupes des semaines après chaque immunisation d’ADN par saignement de la queue. les animaux de chaque groupe ont été regroupés et stockés à – ° C A la fin de l’expérience, tous les échantillons ont été testés par ELISA indirect, pour déterminer les IgG et Réponse anticorps IgGa des animaux aux plaques d’antigène MPB -well Maxisorp; Nalgene Nunc International, Roskilde, Danemark ont ​​été enrobés avec un antigène MPB natif à une concentration de -μg / ml dans du PBS pH, Les plaques ont été incubées à température ambiante pendant h, ont été lavées avec PBS-Tween tampon PBS% v / v Tween- Les plaques ont été lavées et incubées avec du sérum de souris dilué: dans du PBS pendant min à ° C. Les plaques ont été lavées à nouveau et incubées avec un anticorps secondaire conjugué soit IgG-peroxydase de raifort anti-souris [MCAP] ou IgGa-peroxydase de raifort anti-souris [MCAP], à la dilution recommandée par le fabricant Serotec, Kidlington, UK, pour min à ° C Après un lavage final, On a ajouté du tétraméthylbenzidine TMB substrat liquide / chromogène Vetoquinol, Bicester, UK, et les plaques ont été incubées à température ambiante dans l’obscurité pendant min. La réaction a été arrêtée par l’addition de% d’acide sulfurique et a été lue immédiatement à nmWhole-blood prolifer Le sang hépariné a été dilué: dans du milieu de culture RPMI complété avec% CPSR- [Sigma], acides aminés non essentiels [Sigma], × -M-mercaptoéthanol, pénicilline [U / mL] et sulfate de streptomycine [μg / mL] et distribué μL / puits dans des plaques de microtitration à fond plat qui contenaient des solutions d’antigène dans le milieu de culture μL / puits, en tant que déterminations en triplicata Les plaques ont été cultivées pendant plusieurs jours et radiomarquées pendant la dernière h de culture avec kBq de [H] -thymidine Amersham, Amersham, UK par puits, ont été récoltés sur des filtres en fibre de verre et comptés dans un compteur à scintillation. Les résultats sont exprimés en indices de stimulation SI; [cpm avec antigène] / [cpm sans antigène]

Résultats

Les réponses immunitaires chez les souris à la vaccination montrent la réponse sérologique chez les souris BALB / c à MPB après vaccination avec BCG Pasteur, un vaccin ADN qui code MPB pCMV-, ou le contrôle du vecteur ADN pCMV-link Une forte réponse IgG / IgGa à MPB était observée chez des souris immunisées avec pCMV- Les titres d’IgG et d’IgGa sont devenus saturés à: une dilution par la troisième immunisation. En revanche, aucune réponse d’anticorps n’a été détectée chez les souris immunisées avec l’ADN de contrôle pCMV-link ou BCG Pasteur. Le modèle de souris pour l’infection par M bovis a été établi précédemment en titrant des doses de M bovis Initialement, des souches de souris ont été infectées iv avec différents isolats de M bovis à une dose de cfu Les deux isolats de M bovis sur le terrain étaient considérablement plus virulents que ceux signalés pour une dose équivalente de souches virulentes de M. tuberculosis, y compris Erdman, HRV, et un tableau clinique. La plupart des souris sont mortes de chaque souche avant des semaines L’examen post-mortel a révélé une tuberculose sévère affectant les poumons, la rate, le foie et les reins La survie la plus élevée a été observée chez les souris mutantes BALB / c et MRL / Lpr Le modèle impliquait l’utilisation de souris BALB / c et de doses intraveineuses et de cfu M bovis. A ces doses, toutes les souris ont survécu pendant des semaines et ont eu une tuberculose à l’examen post-mortem Avec l’utilisation d’une dose de cfu, les souris BALB / c vaccinées significativement moins M bovis / dans les poumons et la rate que le groupe témoin pCMV-link P & lt; et P & lt; , respectivement; Figure Une protection significative contre le M bovis virulent a été observée dans les poumons et la rate des souris immunisées avec le pCMV-P & lt; pour les deux organes En outre, l’immunisation avec le pCMV a donné une protection significativement plus grande contre M bovis dans la rate que l’immunisation avec le BCG P & lt; Ce n’était pas le cas pour la protection contre le M bovis dans les réponses immunitaires pulmonaires à l’ADN. Après avoir établi que l’ADN codant pour le MPB est à la fois immunogène et capable de déclencher une immunité protectrice chez un petit animal, nous avons testé l’immunogénicité de l’ADN. bovins Huit semaines après la dernière immunisation, les veaux ont été saignés et le sang a été utilisé dans un test de prolifération du sang entier avec soit la protéine MPB recombinante soit PPD-M comme antigène. La figure montre les IS moyens obtenus pour chaque groupe de veaux après Stimulation in vitro avec MPB ou PPD-M à μg / mL L’immunisation des bovins avec l’ADN de contrôle pCMV-, mais pas pCMV-link, a entraîné des réponses prolifératives significatives après stimulation par l’un ou l’autre antigène La réponse au PPD-M était forte réponse mais moins que cela à la protéine recombinante MPB

Discussion

Un certain nombre de stratégies ont été proposées pour le développement de vaccins antituberculeux améliorés, notamment le développement de souches de M bovis ou M tuberculosis rationnellement atténuées, ainsi que l’utilisation de vaccins à sous-unités protéiques et à ADN pour le développement de vaccins sous-unitaires non vivants en raison de la nature générique des processus de production et de purification requis Plusieurs antigènes mycobactériens ont été définis comme protecteurs contre M tuberculosis lorsqu’ils sont administrés en tant que vaccin ADN aux petits animaux, par exemple, notre connaissance, la première à décrire la vaccination par ADN qui confère une protection contre l’infection à M bovis. Plusieurs rapports ont montré que M bovis est plus virulent que M tuberculosis pour les souris et examiné dans . isolats de M bovis au champ avant que des expériences de vaccination-provocation aient été réalisées. Dans les études de Dunn et North , M bovis était plus virulent pour les souris de notre étude que M tuberculosis, causant la mort par tuberculose aiguë. Pour éviter cela, nous avons dû utiliser des logarithmes moins d’un isolat de M bovis dans BALB / c souris qu’une étude similaire utilisant un isolat clinique de M tuberculosis MPB a été choisie pour nos études de vaccination car elle est un antigène dominant lors de l’infection chez les hôtes cibles naturels de M bovis en Grande-Bretagne ie, les bovins et blaireaux Les résultats rapportés ici démontrent que la vaccination ADN avec cet antigène peut conférer une protection significative contre une provocation sévère avec une souche M bovis chez la souris, en particulier dans la rate. Des études antérieures ont montré que tuberculose , il le fait en établissant une réponse immunitaire cellulaire dominée par des lymphocytes T spécifiques de l’antigène qui produisent tous deux de l’IFN-γ et sont cytotoxiques envers les cellules infectées. Réponse immunitaire cellulaire La réponse immunitaire stimulée par la vaccination ADN avec la protéine mpb chez la souris était une réponse mixte IgG / IgGa. Cependant, la nature exacte de la réponse immunitaire qui confère une protection contre l’infection à M bovis reste à élucider. En Grande-Bretagne, la tuberculose chez les bovins est contrôlée par une stratégie de test-et-abattage qui repose sur le test cutané à la tuberculine pour identifier les bovins infectés par M bovis. Pour poursuivre cette stratégie, il est essentiel développer des vaccins qui ne compromettent pas le diagnostic De tels vaccins seraient également utiles chez l’homme, pour permettre l’identification d’individus qui, malgré la vaccination, contractent la tuberculose et nécessitent une chimiothérapie. en immunité protectrice sans sensibiliser les animaux au test cutané à la tuberculine Dans cette étude, Cependant, la question de savoir si la vaccination ADN avec le mpb compromet les tests cutanés tuberculiniques chez les bovins reste à déterminer. En conclusion, nos résultats ont démontré que la vaccination par ADN avec mpb protège les souris contre les infections à M bovis et stimule de fortes réponses prolifératives chez les bovins Des expériences sont actuellement en cours pour déterminer l’efficacité protectrice de ce vaccin contre l’épreuve pulmonaire avec de faibles doses de M bovis chez les cobayes et les bovins |

Infection naturelle et nosocomiale chez un patient atteint d’une encéphalite du Nil occidental et troubles du mouvement extrapyramidal

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